馬婷燕，李彥忠,

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

有“牧草之王”美稱的紫花苜蓿(Medicago sativa)是推動(dòng)牧草產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中的重要牧草[1]。紫花苜蓿屬于中等耐鹽作物[2]，鹽脅迫仍會(huì)威脅苜蓿生長(zhǎng)造成無法估量的產(chǎn)量損失。鹽堿地土壤是世界上干旱和半干旱地區(qū)最普遍的土地資源。截至目前，全世界共有15 億hm2耕地，約7 700 萬(wàn)hm2(約5%)的可耕地面積均受到不同程度土壤鹽堿化的影響。在中國(guó)，鹽化土壤的面積約為3 400 萬(wàn)hm2，約占總耕地面積的1/3[3]。土壤中適宜含量的鹽分對(duì)維持植物正常生理功能方面發(fā)揮著重要作用，而過量鹽分導(dǎo)致土壤鹽漬化，使得植物根部吸水困難，植物體內(nèi)與水分相關(guān)的滲透調(diào)節(jié)受到阻礙，從而導(dǎo)致植株組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，影響生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而有可能使得栽培地局部小氣候失調(diào)，最終影響產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益[4]。

甜菜堿(glycine betaine, GB)是一種水溶性生物堿，無毒無害且廣泛存在于動(dòng)植物中，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓以維持生物膜及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的完整[5]。當(dāng)遭受非生物脅迫例如鹽堿、旱澇、高低溫等逆境時(shí)，許多植物體內(nèi)都會(huì)積累甜菜堿[6]，但往往因?yàn)榉e累量不夠多而發(fā)揮效用微弱。研究發(fā)現(xiàn)，添加適量的外源誘導(dǎo)劑如甜菜堿、水楊酸、2,4-表油菜素內(nèi)酯等可以提高植物的抗逆性，在減少脅迫傷害促生保收方面表現(xiàn)良好[7-9]。幼苗期根試適宜濃度的甜菜堿可以有效緩解鹽脅迫對(duì)小麥(Triticum aestivum)幼苗葉片造成的傷害，增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，并維持相關(guān)抗氧化酶活性，提高小麥的抗鹽性[10]。此外，學(xué)者們通過施加外源甜菜堿增強(qiáng)棉花(Gossypiumspp.)[11]、玉米(Zea mays)[12]、大麥(Hordeum vulgare)[13]、水稻(Oryza sativa)[14]、番茄(Lycopersicon esculentum)[15]和黑果枸杞(Lyicumruthenicum)[16]等作物的耐性抗性方面取得了一些進(jìn)展，主要體現(xiàn)在對(duì)離子吸收平衡的影響、滲透物質(zhì)及生物膜透性調(diào)節(jié)、抗氧化酶活性以及光合功能的改善等。利用外源甜菜堿提高紫花苜蓿耐鹽性研究方面，國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道較少；同時(shí)，甜菜堿的合成工藝已非常純熟且具有理化性質(zhì)穩(wěn)定，易于被植物吸收的特點(diǎn)[17]。為此，本研究選取在西北干旱、半干旱地區(qū)廣泛栽培的‘甘農(nóng)3 號(hào)’紫花苜蓿(Medicago sativa‘Gannong No. 3’)為研究材料，分析兩種施用方式、6 個(gè)濃度的甜菜堿對(duì)NaCl 脅迫時(shí)紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，旨在為利用外源甜菜堿提高紫花苜?？果}性提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究于2019 年1 月-2 月在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院開展。參試材料為‘甘農(nóng)3 號(hào)’紫花苜蓿由蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院提供；外源甜菜堿購(gòu)自Sigma 公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 處理液配置

150 mmol·L-1NaCl 溶液模擬中度鹽脅迫和外源甜 菜 堿 溶 液0、10、20、30、40、50 mmol·L-1共6 個(gè)濃度，對(duì)照CK 為蒸餾水替代處理液。

1.2.2 發(fā)芽試驗(yàn)

采用紙上發(fā)芽法[18]，在鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑90 mm)中同時(shí)加入4 mL 處理液[處理液為脅迫液∶緩解液(1∶1)的混合液]，將選取的苜蓿種子室溫下用蒸餾水浸泡40 min，消毒處理經(jīng)乙醇(75%)浸泡30 s，NaClO(20%)浸泡15 min，滅菌水沖洗5～6 次，最后用濾紙將水吸干，并將種子均勻置于發(fā)芽床上，一皿50 粒，共6 個(gè)處理，每處理4 次重復(fù)，置于恒溫培養(yǎng)箱(溫度25 ℃，光照/黑暗時(shí)間為12 h/12 h，光照強(qiáng)度2 000 lx)，每天采用稱重法加補(bǔ)散失的水分。

1.2.3 盆栽試驗(yàn)

選擇顆粒飽滿的干凈種子，播入營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石為2∶1 的育苗缽內(nèi)(直徑為 20 cm, 高度為20 cm)，期間用營(yíng)養(yǎng)液(改良版Hoagland)和蒸餾水交替澆灌。每缽留長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗定苗10 株，30 d 后測(cè)量株高，采用葉施和根注的方式添加外源甜菜堿，共12 個(gè)處理，每處理4 次重復(fù)，并設(shè)置清水對(duì)照CK；葉施時(shí)，先用25 mL NaCl 溶液根部灌注，再用25 mL 甜菜堿溶液保證噴施到所有葉片為準(zhǔn)；根注時(shí)，將NaCl 溶液和甜菜堿溶液各25 mL混合均勻后用注射器注于苜蓿幼苗根部周圍。于試驗(yàn)處理后的1、3、5 d 時(shí)噴施或澆灌相應(yīng)的處理液，7 d 時(shí)采集葉片測(cè)定其生理生化指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 發(fā)芽指標(biāo)測(cè)定

發(fā)芽試驗(yàn)期間逐日統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)(發(fā)芽以胚根突破種皮為準(zhǔn))，14 d 時(shí)停止發(fā)芽依據(jù)以下公式計(jì)算發(fā)芽相關(guān)指標(biāo)，測(cè)胚芽、胚根的長(zhǎng)度及組織含水量。發(fā)芽勢(shì) = 4 d 發(fā)芽種子數(shù)/參試種子數(shù) × 100%；發(fā)芽率 = 發(fā)芽結(jié)束時(shí)的發(fā)芽總數(shù)/參試種子數(shù) ×100%；

相對(duì)發(fā)芽勢(shì) = (處理組發(fā)芽勢(shì)/對(duì)照組發(fā)芽勢(shì)) ×100%；

相對(duì)發(fā)芽率 = (處理組發(fā)芽率/對(duì)照組發(fā)芽率) ×100%； ∑

發(fā)芽指數(shù) = Gt/Dt；

活力指數(shù) = GI × S；相對(duì)發(fā)芽指數(shù) = (處理組發(fā)芽指數(shù)/對(duì)照組發(fā)芽指數(shù)) × 100%；

相對(duì)活力指數(shù) = (處理組活力指數(shù)/對(duì)照組活力指數(shù)) × 100%。

式中：Gt為在時(shí)間t 日的發(fā)芽數(shù)，Dt為萌芽日數(shù)，GI 為發(fā)芽指數(shù), S 為14 d 時(shí)的幼苗長(zhǎng)度。

1.3.2 盆栽試驗(yàn)中的株高測(cè)定

用直尺測(cè)量苜蓿幼苗莖基部到頂葉的距離作為株高，測(cè)量時(shí)確保頂葉舒展，植株直立。植株增長(zhǎng) = 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)株高-試驗(yàn)開始時(shí)株高；組織含水量的測(cè)定：隨機(jī)取10 株處理7 d 后的植株，將根部沖洗干凈，置于濾紙上干燥，用剪刀將根、莖、葉切分，電子天平稱量各組織鮮重(Wf)，放于80 ℃烘箱烘干至恒重，稱量各組織干重(Wd)。組織含水量 = [(Wf-Wd)/Wf] × 100%。

1.3.3 抗逆生理指標(biāo)測(cè)定

采用乙醇提取法測(cè)定葉綠素含量[19]，采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖(soluble sugar, SS)含量[19]，采用酸性茚三酮法測(cè)定游離脯氨酸(proline, Pro)含量[19]，采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定丙二醛(malonaldehyde, MDA)含量[19]。

1.3.4 抗氧化酶活性測(cè)定

采用氮藍(lán)四唑顯色法測(cè)定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)[19]，紫外比色法測(cè)定過氧化氫酶(catalase, CAT)活性[19]，愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶(peroxidase, POD)活性[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010 整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行圖表繪制；采用SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)不同處理的數(shù)據(jù)選用單因素ANOVA 分析處理，Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較(P＜0.05)。以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

2.1.1 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對(duì)苜蓿種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響

NaCl 脅迫下，隨外源甜菜堿濃度的增加，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，其中30 mmol·L-1的甜菜堿處理下發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率最高，分別為86.50%和96.50%，分別是僅有NaCl 脅迫處理的2.01 倍和1.82 倍(表1)。結(jié)果表明，施加適宜濃度的甜菜堿可有效緩解NaCl 對(duì)苜蓿種子萌發(fā)的抑制作用，低于或高于此濃度，緩解作用都會(huì)降低。

2.1.2 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對(duì)苜蓿種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

NaCl 脅迫時(shí)，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)隨外源甜菜堿濃度的增加呈先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)外源甜菜堿在30 mmol·L-1時(shí)發(fā)芽指數(shù)最高，在40 mmol·L-1處理時(shí)活力指數(shù)最高，分別18.02%和96.26%，是僅有NaCl 脅迫處理的1.73 倍和3.27 倍(表2)。

表 1 NaCl 脅迫下施加外源甜菜堿對(duì)苜蓿種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響Table 1 Effects of exogenous glycine betaine on germination potential and germination percentage of alfalfa seeds under NaCl stress

表 2 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對(duì)苜蓿種子發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)的影響Table 2 Effects of exogenous glycine betaine on germination index and vigor index of alfalfa seeds under NaCl stress

2.1.3 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對(duì)苜蓿種子胚根與胚芽生長(zhǎng)的影響

在NaCl 脅迫下，當(dāng)外源甜菜堿施加50 mmol·L-1時(shí)苗長(zhǎng)最大，施加40 mmol·L-1時(shí)根長(zhǎng)最大，分別為1.40 和5.51 cm，是僅有NaCl 脅迫處理的1.73 倍和3.04 倍(表3)。

2.2 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對(duì)盆栽苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響

與CK 相比，當(dāng)NaCl 脅迫時(shí)苜蓿幼苗的株高顯著降低，外源甜菜堿在20～40 mmol·L-1范圍內(nèi)株高明顯增大，當(dāng)葉面噴施30 mmol·L-1的甜菜堿時(shí)株高最大；當(dāng)根部灌注40 mmol·L-1的甜菜堿時(shí)株高最大，二者株高均大于CK (P＜0.05)，且葉施效果要優(yōu)于根注效果(圖1)。這在一定程度上可以說明，施加外源甜菜堿不僅可以緩解NaCl 的脅迫作用，濃度適宜時(shí)還可以促進(jìn)苜蓿幼苗的生長(zhǎng)。

與CK 相比，盆栽苜蓿幼苗經(jīng)NaCl 脅迫組織含水量顯著下降( P＜0.05)，施加甜菜堿后幼苗含水量開始升高。葉施和根注甜菜堿都在30 mmol·L-1時(shí)含水量達(dá)最大，但仍小于CK (P＜0.05)。這說明在NaCl 脅迫時(shí)，添加甜菜堿可以改善紫花苜蓿幼苗代謝，增強(qiáng)組織儲(chǔ)水能力。

表 3 NaCl 脅迫下施加外源甜菜堿對(duì)苜蓿種子胚根與胚芽生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of exogenous glycine betaine on the growth of root and germ of alfalfa seeds under NaCl stress

與CK 相比，在NaCl 脅迫下幼苗的葉綠素量開始下降，當(dāng)施加甜菜堿后葉綠素含量有所回升。當(dāng)葉施甜菜堿30 mmol·L-1和根注甜菜堿40 mmol·L-1都使葉綠素含量達(dá)到最大。這表明，施用一定濃度的甜菜堿能顯著增加葉綠素含量以改善苜蓿幼苗受到NaCl 脅迫時(shí)的光合作用條件，提高光合效率，增強(qiáng)植株對(duì)高鹽度環(huán)境的適應(yīng)。

圖 1 外源甜菜堿對(duì)NaCl 脅迫下苜蓿幼苗株高、組織含水量、葉綠素含量的影響Figure 1 Effects of exogenous glycine betaine on plant height,tissue water content, and chlorophyll content of alfalfa seedlings under NaCl stress

2.3 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對(duì)苜蓿幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及丙二醛含量的影響

在逆境條件下，可溶性糖(SS)會(huì)積累增加來調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透性從而維持植物的生長(zhǎng)發(fā)育。CK 處理下，SS 含量處于正常水平，而幼苗受到NaCl 脅迫時(shí)，SS 含量明顯增加，可降低植物細(xì)胞滲透勢(shì)，使植株盡可能維持正常的生長(zhǎng)代謝水平，平安度過脅迫期。隨著外源甜菜堿濃度的施加，幼苗的SS 含量逐漸上升，當(dāng)葉施和根注濃度分別在30、40 mmol·L-1時(shí)，顯著高于CK (P＜0.05)(圖2)。

游離脯氨酸(Pro)作為一類高效的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境條件下會(huì)在植物體內(nèi)大量累積而維持植物的生長(zhǎng)發(fā)育水平。與CK 相比，當(dāng)幼苗受到NaCl 脅迫時(shí)Pro 含量開始增大，隨著甜菜堿濃度的增加，Pro 含量也呈增大的趨勢(shì)，其中當(dāng)葉施和 根 施 甜 菜 堿 分 別 在30 和40 mmol·L-1時(shí)，Pro 含量最大，且與其他處理差異顯著(P＜0.05) (圖2)。

逆境脅迫條件下膜脂過氧化作用產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞膜有害的MDA，其含量的多少與植物細(xì)胞膜受傷害程度正相關(guān)。與CK 相比，當(dāng)植株受到NaCl 脅迫時(shí)，MDA 含量大幅度增大，隨著甜菜堿的施用，MDA 含量略有下降，當(dāng)葉施和根施分別在30 和40 mmol·L-1時(shí)，MDA含量下降到最低(圖2)。說明適宜濃度的甜菜堿有效降低苜蓿幼苗細(xì)胞膜的受損程度。

2.4 NaCl 脅迫下外源甜菜堿對(duì)苜蓿幼苗抗氧化酶活性的影響

與CK 相比，當(dāng)植株受到NaCl 脅迫時(shí)，植物細(xì)胞內(nèi)自由基的平衡遭到破壞，不斷加劇細(xì)胞膜的過氧化最終導(dǎo)致植物受到損傷。苜蓿葉片的3 種抗氧化酶的活性都大幅度提升，而兩種方式施加不同濃度的甜菜堿使SOD、POD、CAT 的活性均維持在較高水平，且都隨甜菜堿濃度增加呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)葉施為30 mmol·L-1時(shí)與根注為40 mmol·L-1時(shí)，活性均達(dá)到最大，與CK 相比差異顯著(P＜0.05) (圖3)。這說明，苜蓿幼苗在受到鹽脅迫時(shí)，抗氧化酶系統(tǒng)受到刺激活性增加，而施加適宜濃度的甜菜堿可以維持正常的抗氧化酶活性水平，維持植株的抗逆能力。

圖 2 外源甜菜堿對(duì)NaCl 脅迫下苜蓿幼苗SS、Pro 及MDA 含量的影響Figure 2 Effects of exogenous glycine betaine on SS, Pro, and MDA contents of alfalfa seedlings under NaCl stress

圖 3 外源甜菜堿對(duì)NaCl 脅迫下苜蓿幼苗抗氧化酶活性的影響Figure 3 Effects of exogenous glycine betaine on antioxidant enzyme activity of alfalfa seedlings under NaCl stress

3 討論與結(jié)論

西北地區(qū)土壤普遍鹽堿化，而鹽分脅迫主要通過滲透脅迫損害植物細(xì)胞膜，造成氧化脅迫以及蛋白質(zhì)合成受阻等抑制植物的萌發(fā)及生長(zhǎng)發(fā)育。孟繁昊等[20]表明，植物耐鹽性主要依賴于滲透調(diào)節(jié)保護(hù)膜完整性與穩(wěn)定性、改變光合效率及完成活性氧清除。本研究中，NaCl 脅迫明顯抑制了苜蓿的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，相比對(duì)照組，鹽脅迫下發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都顯著下降，幼苗則表現(xiàn)為組織含水量、葉綠素含量、可溶性糖含量、游離脯氨酸含量均有顯著降低，MDA 急劇升高，SOD、POD 及CAT 的活性明顯增強(qiáng)來響應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。

關(guān)于對(duì)甜菜堿提高植物抵抗環(huán)境脅迫的研究已有 許 多[5,7,21-22]。起 初，學(xué) 者 們[5,22-23]發(fā) 現(xiàn) 植 物 體 內(nèi)產(chǎn)生的甜菜堿對(duì)于調(diào)控植物抗鹽抗旱等不良環(huán)境方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而在生產(chǎn)實(shí)踐中，并非所有種類的植物在受到環(huán)境脅迫時(shí)都能產(chǎn)生并積累足夠量的甜菜堿[24-26]。后來研究者們針對(duì)添加外源甜菜堿和甜菜堿合成基因工程在提高植株抗逆能力方面進(jìn)行了長(zhǎng)期且深入的研究[22,27-28]。一些研究表明[29-32]，鹽、低溫、干旱等非生物脅迫可誘導(dǎo)內(nèi)源甜菜堿的合成與積累量增加以增強(qiáng)抗逆水平；董文科等[29]研究表明，通過葉施或根施外源甜菜堿也可誘導(dǎo)植物增加內(nèi)源甜菜堿的合成量，對(duì)于植物抵御低溫等非生物脅迫也有幫助。梁超[33]通過轉(zhuǎn)基因方式將BADH 基因?qū)胄←?Triticum aestivum)，在小麥中表達(dá)而使葉片中甜菜堿過量積累，提高葉片相對(duì)含水量，維持葉片的水分狀況，并增加葉綠素含量，光合效率得以提高從而增強(qiáng)了小麥的耐鹽能力。孫文越等[34]研究了外源甜菜堿對(duì)干旱脅迫下小麥生理變化影響，發(fā)現(xiàn)外源甜菜堿可以使小麥葉片含水量降低，相對(duì)電導(dǎo)率增大，MDA 含量上升，游離脯氨酸大量積累，抗氧化酶活性先降后增，得出外施甜菜堿會(huì)加深對(duì)小麥幼苗受傷害程度的結(jié)論。這與許多學(xué)者的研究結(jié)果相悖，推測(cè)可能是因?yàn)橥庠刺鸩藟A被小麥的吸收太少得出此結(jié)果。這些研究可以說明，甜菜堿吸收及積累量的增加有助于增強(qiáng)植物在抵御逆境脅迫的能力，抵御機(jī)制同抗逆機(jī)理類似中[35]。

植物生長(zhǎng)發(fā)育的最基礎(chǔ)環(huán)節(jié)是種子萌發(fā)，因此種子的耐鹽能力顯得非常關(guān)鍵。本研究中，與對(duì)照相比，當(dāng)外源甜菜堿施加范圍在20～40 mmol·L-1時(shí)苜蓿種子在萌發(fā)過程中的鹽抑制作用得到不同程度的緩解，并且在30 mmol·L-1外源甜菜堿的水平下，發(fā)芽情況達(dá)到鹽脅迫下的最好狀態(tài)。許高平等[36]研究發(fā)現(xiàn)，用甜菜堿浸種能夠顯著提升干旱與鹽脅迫下玉米(Zea mays)種子的發(fā)芽勢(shì)發(fā)芽率。已有很多類似研究表明，在鹽脅迫下添加外源甜菜堿明顯會(huì)改善煙草(Nicotiana tabacum)、枸杞(Lycium barbarum)、番茄(Solanum lycopersicum)和白三葉(Trifolium repens)等種子的萌發(fā)情況[24,37-39]，與本研究結(jié)果一致。葉綠素是植物光合作用中的關(guān)鍵部分，其含量的多少在一定程度上可以反映植物的光能吸收、轉(zhuǎn)化和傳遞能力，其含量與葉片光合速率、外界環(huán)境條件等緊密相關(guān)，因此葉綠素含量一定程度能表征植物生長(zhǎng)狀況[40-41]。本研究中，與對(duì)照相比，外源甜菜堿能增加NaCl 脅迫下苜蓿幼苗的株高、組織含水量、葉綠素含量，當(dāng)葉施30 mmol·L-1和根注40 mmol·L-1的水平時(shí)，各指標(biāo)值顯著大于對(duì)照處理，說明適宜濃度的甜菜堿能夠維持葉片的水分狀況，同時(shí)增加光合效率，從而抵御鹽脅迫并且促進(jìn)苜蓿幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育。梁超[33]研究表明，甜菜堿保護(hù)逆境條件下葉綠體體積不受鹽脅迫，促進(jìn)葉綠素合成，改善光合效率以增加生物量積累來增強(qiáng)植株抗鹽性，這與本研究的結(jié)果符合。

可溶性糖和游離脯氨酸可通過調(diào)節(jié)原生質(zhì)水溶液的滲透壓來保護(hù)植物細(xì)胞膜[42-44]。本研究表明，幼苗葉片在NaCl 脅迫時(shí)，SS 和 Pro 含量提高，降低了鹽脅迫對(duì)植物細(xì)胞造成的傷害，而外源甜菜堿無論葉施還是根注都可以繼續(xù)增加這兩種物質(zhì)的含量，分別在30 mmol·L-1和40 mmol·L-1達(dá)到最大，進(jìn)一步表明外源甜菜堿可有效提高苜蓿的抗鹽性。孟祥浩[45]在小麥抗鹽試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小麥葉片脯氨酸含量隨鹽濃度增大及脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而有不同程度的增加，耐鹽品種的脯氨酸含量積累明顯較多，說明游離脯氨酸含量的積累增多可有效提高小麥的耐鹽性。丙二醛能與膜結(jié)構(gòu)上的蛋白質(zhì)或酶結(jié)合、交聯(lián)而使其失去活性，膜結(jié)構(gòu)被破壞，因此MDA 含量可以有效反映生物膜系統(tǒng)受損程度和膜脂過氧化程度[46-48]。本研究中，NaCl對(duì)幼苗造成脅迫時(shí)，MDA 含量較CK 處理急劇增加，說明鹽逆境加劇了膜脂過氧化程度，生物膜系統(tǒng)受損。隨著甜菜堿溶液濃度的增加，幼苗葉片中的MDA 含量相應(yīng)有所降低，葉施和根注外源甜 菜 堿 分 別 在30、40 mmol·L-1時(shí) 葉 片MDA 含 量降到鹽脅迫下最低水平。原因可能是甜菜堿可以保護(hù)酶蛋白結(jié)構(gòu)和功能的完整性，阻礙了MDA 對(duì)膜的損傷，維持植物細(xì)胞的正常工作，從而提高了苜?？果}性。李蕓瑛等[30]利用外源甜菜堿處理黃瓜(Cucumis sativas)幼苗，結(jié)果也表明外源甜菜堿可以有效保護(hù)低溫脅迫對(duì)幼苗的傷害而抑制MDA合成，以防止膜脂過氧化加劇，維持了生物膜系統(tǒng)的平衡。

鹽脅迫會(huì)使植物產(chǎn)生大量活性氧自由基，造成植物細(xì)胞膜損傷。因此，提高抗氧化酶活性來清除活性氧自由基對(duì)植物在鹽逆境下的存活至關(guān)重要。SOD、POD 和CAT 是3 類與植物抗逆機(jī)制相關(guān)的抗氧化關(guān)鍵酶，抗氧化關(guān)鍵酶活性的提高能一定程度上減緩植物細(xì)胞受到的氧化損傷[49-52]。本研究中，鹽脅迫時(shí)幼苗葉片的這3 種酶活性較CK 相 比 略 有 提 高，而 葉 施30 mmol·L-1和 根 注40 mmol·L-1外 源 甜 菜 堿 時(shí) 這3 種 酶 活 性 顯 著 提高，說明外源甜菜堿可以激發(fā)抗氧化酶活性，以清除過多活性氧自由基。研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿可以與酶蛋白結(jié)合，維持酶蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性，使酶蛋白處于激活狀態(tài)，同時(shí)維護(hù)呼吸酶及能量的代謝過程，增加保護(hù)酶活性以清除體內(nèi)的活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞、蛋白質(zhì)和酶不受來自不良土壤環(huán)境與極端天氣等外界因素的影響，最終提高了植物抵御逆境脅迫的能力[17,53-54]。梁超[33]通過基因工程證明，過量積累甜菜堿可以保護(hù)植株在鹽脅迫下各種抗氧化酶活性，減少活性氧的積累，降低MDA 水平，維持生物膜的有序性。這與本研究結(jié)果一致。

本研究中，葉片噴灑在30 mmol·L-1時(shí)，根部灌注在40 mmol·L-1時(shí)，各項(xiàng)生理指標(biāo)顯示苜蓿幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)與抗逆狀態(tài)達(dá)最佳效果。這可能是因?yàn)橛糜谂嘤酌绲耐寥澜橘|(zhì)中本身存在一類化合物(醛類和有機(jī)酸等)[55]，能夠和甜菜堿中的元素或衍生物產(chǎn)生特異性反應(yīng)結(jié)合，降低甜菜堿的濃度和吸收量，也可能因?yàn)橥庠刺鸩藟A從根部向葉片吸收運(yùn)輸?shù)倪^程中有損耗，使得植株葉片得以積累利用的甜菜堿量較少，從而降低了抗鹽效果，因此根注所需甜菜堿濃度要大于葉施所需濃度。這說明外源甜菜堿對(duì)植物抗逆性的影響與其施加方式和濃度有一定的關(guān)系。

綜上可以得知外源甜菜堿一定程度下有助于增強(qiáng)紫花苜蓿萌發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育在鹽逆境下的抗逆能力。在NaCl 脅迫時(shí)，0～50 mmol·L-1的外源甜菜堿處理提高了紫花苜蓿種子萌發(fā)指標(biāo)，增加了幼苗的葉綠素、可溶性糖和游離脯氨酸的含量，降低了丙二醛的積累，顯著提高抗氧化酶的活性，使苜蓿種子萌發(fā)期與幼苗期的抗鹽能力得到不同程度的提升。在葉面噴施濃度為30 mmol·L-1外源甜菜堿，根部灌注濃度為 40 mmol·L-1的處理下效果最佳。