鄭 琳，魏炳棟，張立春，何中國，于 維，趙嶺樂，王 欣

（1. 吉林省農(nóng)業(yè)科學院畜牧科學分院，吉林 公主嶺 136100；2. 吉林省農(nóng)業(yè)科學院花生所，吉林 公主嶺 136100；3. 公主嶺市環(huán)保局，吉林 公主嶺 136100）

隨著畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，常規(guī)飼料資源的需求量已不能滿足畜牧業(yè)發(fā)展的要求，飼料資源的不當處理，也造成了嚴重的環(huán)境問題。如何合理利用飼料資源是緩解飼料資源短缺和保護生態(tài)環(huán)境的關鍵[1]。羊草(Leymus chinensis)作為吉林省西部草原區(qū)的優(yōu)勢草種，其適口性強，具有較高的營養(yǎng)價值，是東北地區(qū)牧場種植的優(yōu)良草種[2]。由于其產(chǎn)量高、質量優(yōu)，也是吉林省各種草食家畜的優(yōu)質干草資源[3]。花生(Arachis hypogaea)是我國重要的油料作物之一，種植面積僅次于油菜(Brassica campestris)，位居第二，花生秧與花生殼是花生收割時期產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物[4]?；ㄉ碜鳛橐环N優(yōu)質飼料資源，國內學者分別從地區(qū)[5]、品種[6]、收獲時間和高度[7-8]等方面對其進行了營養(yǎng)價值評定；馮豆等[9]首次利用近紅外反射光譜技術快速檢測花生秧的常規(guī)營養(yǎng)成分，該技術能夠精準預測花生秧中的干物質(dry matter, DM)、粗蛋白質(crude protein, CP)及中性洗滌纖維(neutral detergent fibre,NDF)含量；黃帥等[10]和楊雪海等[11]也對不同地區(qū)的花生殼進行了營養(yǎng)價值評定。

羊草作為吉林省的優(yōu)質飼草資源已在畜牧業(yè)中得到了廣泛的應用，其營養(yǎng)價值方面的研究相對較多，但對于吉林省花生副產(chǎn)物的營養(yǎng)價值研究還鮮見報道。且國內關于花生副產(chǎn)物的營養(yǎng)價值評定多集中于常規(guī)營養(yǎng)成分分析及瘤胃降解特性等方面的研究，對于體外發(fā)酵特性方面的研究也甚少。體外產(chǎn)氣法是評定粗飼料營養(yǎng)成分可利用率的一種方法，該方法可根據(jù)不同粗飼料在一定時間內產(chǎn)氣量與產(chǎn)氣速率的不同，來估測其有機物的消化率，與其他方法相比，重復性好、自動化程度高，得到了國內外的廣泛認可[12]。

因此，本研究利用體外產(chǎn)氣法分析花生秧、花生殼與羊草3 種粗飼料的體外發(fā)酵特性，以羊草作為對照，通過比較花生副產(chǎn)物與羊草各發(fā)酵參數(shù)的不同對其進行營養(yǎng)價值評定，以期為吉林省花生副產(chǎn)物的合理開發(fā)與利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 飼料原料的采集與處理

試驗所用花生秧采于吉林省雙遼地區(qū)，9 月20 日收割，品種名為“科富花2 號”；花生殼粉碎后制粒；羊草采于吉林省農(nóng)業(yè)科學院畜牧科學分院。原料經(jīng)采集后于65 ℃烘干制成風干樣品，粉碎過1 mm 篩，密封保存以備用。3 種飼料原料的營養(yǎng)成分如表1 所列。

表 1 3 種粗飼料的營養(yǎng)成分(干物質基礎)Table 1 Nutritional components of three types of roughage (DM basis)

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

試驗所選用的瘤胃液供體牛為3 頭健康，年齡、體重相近的裝有永久性瘤胃瘺管的草原紅牛，每天于08:00 和18:00 各飼喂一次，自由采食羊草，自由飲水。

1.3 體外產(chǎn)氣試驗

1.3.1 人工瘤胃緩沖液的制備

人工瘤胃緩沖液配制參照Menke 和Steingass[13]的方法。量取520.2 mL 蒸餾水，分別加入0.1 mL A 液、208.1 mL B 液、208.1 mL C 液 和1.0 mL D 液 于1 000 mL 容量瓶中，放置過夜，臨用前加入62.4 mL E 液，至于39 ℃恒溫水浴中，持續(xù)沖入CO2氣體，直至緩沖液由淺藍色轉變?yōu)榻鼰o色即可[14]。

1.3.2 瘤胃液的采集

試驗當日晨飼前，分別從3 頭供試動物的瘤胃內采集足量的瘤胃液于存有CO2氣體的保溫瓶中，蓋嚴瓶口，迅速帶回實驗室。攪拌均勻后經(jīng)尼龍布過濾，將濾液置于39 ℃恒溫水浴中，并持續(xù)沖入CO2氣體以確保瘤胃液處于厭氧環(huán)境。

1.3.3 試驗過程

稱取2 g 飼料原料于發(fā)酵罐中，置于39 ℃恒溫水浴中預熱30～60 min，然后加入之前配置好的緩沖液和瘤胃液，緩沖液與瘤胃液的比例為2∶1，緩沖液100 mL，瘤胃液50 mL，于39 ℃的水浴搖床中進行體外發(fā)酵，轉速為80 r·min-1，每個樣品5 個重復，并設定空白對照，利用Qtfxy-6 型產(chǎn)氣裝置進行體外產(chǎn)氣量數(shù)據(jù)的采集[15]。發(fā)酵結束后將發(fā)酵液于-20 ℃保存，用于后續(xù)各項發(fā)酵參數(shù)的測定。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 常規(guī)營養(yǎng)成分

3 種粗飼料的干物質(dry matter, DM)、粗蛋白質(crude protein, CP)、鈣(Ca)和磷(P)的測定參照張麗英[16]的方法。中性洗滌纖維(neutral detergent fibre, NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fibre,ADF)的測定參照Van Soest[17]的方法。

1.4.2 產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣動力學參數(shù)

產(chǎn)氣裝置自動采集每個發(fā)酵罐每6 min 的平均產(chǎn)氣量，通過計算獲得2、4、6、8、12、24 h 各時間點的累計產(chǎn)氣量，根據(jù)以下公式計算產(chǎn)氣量：

式中：GPt為在t 時間點累計發(fā)酵產(chǎn)氣量(mL·g)-1，Vt為樣品罐指定時間內的累計產(chǎn)氣量(mL)，V0為空白罐指定時間內的累計產(chǎn)氣量(mL)，W 為樣品干物質含量(g)。

產(chǎn)氣動力學參數(shù)依據(jù)France 等[18]提出的方程進行計算，方程如下：

式中：GPt為在t 時間點累計發(fā)酵產(chǎn)氣量(mL·g-1)，A 為 理 論 最 大 產(chǎn) 氣 量(mL·g-1)，b 為 產(chǎn) 氣 速 率(mL·h-1)，LAG 為體外發(fā)酵產(chǎn)氣延滯時間(h)，t 為發(fā)酵時間(h)。

根據(jù)式(3)計算達到最大產(chǎn)氣量1/2 時的產(chǎn)氣速率(AGPR, mL·h-1)[19]：

1.4.3 pH

發(fā)酵結束后立即用pHS-3C 型pH 計測定各發(fā)酵液的pH。

1.4.4 氨態(tài)氮

取發(fā)酵液10 mL，5 400 r·min-1離心10 min，取上清液做適當稀釋，參照馮宗慈和高民[20]改進方法，采用L9 型紫外-可見分光光度計測定吸光度值，波長700 nm，根據(jù)標準曲線及吸光度值求出發(fā)酵液的氨態(tài)氮濃度。

1.4.5 微生物蛋白

采用差速離心法分離獲得細菌組分[21]。發(fā)酵結束后取發(fā)酵液50 mL 經(jīng)四層紗布過濾，于1 200 r·min-1離 心15 min 去 除 原 蟲 和 飼 料 大 顆 粒，將 上清液于7 630 r·min-1離心30 min，棄去上清液，用9%的生理鹽水重懸菌體，清洗兩次，沉淀即為細菌組分，采用凱氏定氮法測定細菌組分的微生物蛋白濃度。

1.4.6 揮發(fā)性脂肪酸

樣品前處理：發(fā)酵液搖勻之后，取樣加入2 mL水(1∶3 磷酸水溶液)，渦旋均漿2 min，加入2 mL乙醚萃取10 min，4 000 r·min-1離心20 min (做低溫處理，放置于冰水浴中離心)；離心后取出乙醚相，再加入2 mL 乙醚萃取10 min，4 000 r·min-1離心分離，離心后再次取出乙醚相，將兩次萃取液合并揮發(fā)定容至2 mL，進樣分析。

用賽默飛世爾氣質聯(lián)用儀進行分析。色譜柱為TG WAX 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm。升溫程序：初始溫度100 ℃，保留5 min，以5 ℃·min-1升溫至150 ℃，再以30 ℃·min-1升溫至240 ℃，保留30 min。流速1 mL·min-1，分流比75∶1，載氣為氦氣，進樣器溫度240 ℃。質譜：EI 源；轟擊電壓：70 eV；單離子掃描模式：定量離子60、73；離子源溫度：200 ℃；連接線溫度：250 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 種粗飼料不同時間點的體外產(chǎn)氣量和體外發(fā)酵數(shù)據(jù)先經(jīng)Excel 2007 進行初步整理，然后利用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和顯著性檢驗，采用Duncan 氏法對數(shù)據(jù)進行多重比較，試驗結果用平均值 ± 標準誤表示，差異顯著的判定標準為P＜0.05；通過SAS 9.1軟件的NON-LINEAR 方法計算產(chǎn)氣動力學參數(shù)。

2 結果與分析

2.1 3 種粗飼料的體外發(fā)酵產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣動力學參數(shù)

3 種粗飼料在不同時間點的累計產(chǎn)氣量和達到最大產(chǎn)氣量1/2 時的產(chǎn)氣速率結果一致，為花生秧 ＞ 花生殼 ＞ 羊草，三者之間差異顯著(P＜0.05)；花生秧的理論最大產(chǎn)氣量顯著高于花生殼和羊草(P ＜0.05)，花生殼與羊草之間差異不顯著(P ＞ 0.05)；羊草的產(chǎn)氣速率和產(chǎn)氣延滯時間顯著高于花生秧和花生殼，三者之間差異顯著(P＜0.05) (表2)。

表 2 3 種粗飼料不同時間點產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣動力學參數(shù)Table 2 GP at different time points and kinetic parameters of three types of roughage

2.2 3 種粗飼料體外發(fā)酵24 h 的pH 及揮發(fā)性脂肪酸含量

體外發(fā)酵24 h 后，3 種粗飼料的pH 為羊草最高，花生秧最低，三者之間差異顯著(P ＜0.05)；乙酸比例無顯著性差異(P ＞ 0.05)；丙酸的比例為花生秧最高，其次是花生殼，羊草最低，三者之間差異顯著(P＜0.05)；丁酸的比例為羊草最高，其次是花生殼，花生秧最低，三者之間差異顯著(P＜0.05)；總揮發(fā)性脂肪酸含量為花生秧最高，且顯著高于花生殼和羊草(P＜0.05)，花生殼與羊草之間差異不顯著(P ＞ 0.05)；乙酸/丙酸的值為羊草最高，且顯著高于花生秧和花生殼(P＜0.05)，花生秧與花生殼之間差異不顯著(P ＞ 0.05) (表3)。

2.3 3 種粗飼料體外發(fā)酵24 h 的氨態(tài)氮濃度及微生物蛋白含量

氨態(tài)氮濃度為羊草最高，且顯著高于花生秧和花生殼(P＜0.05)，花生秧與花生殼之間差異不顯著(P ＞ 0.05)。微生物蛋白含量為花生秧最高，羊草最低，三者之間差異顯著(P＜0.05) (表4)。

3 討論

3.1 不同粗飼料對體外產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣動力學參數(shù)的影響

體外發(fā)酵期間產(chǎn)生的氣體主要包括瘤胃微生物發(fā)酵底物產(chǎn)生的二氧化碳、甲烷及揮發(fā)性脂肪酸經(jīng)緩沖作用生成的二氧化碳[22]。累計產(chǎn)氣量的高低一定程度上反映了瘤胃微生物對發(fā)酵底物的利用程度和瘤胃微生物的自身活性[23]。湯少勛等[24]研究發(fā)現(xiàn)，不同品種秸稈在各時間點的產(chǎn)氣量與NDF、ADF 含量呈顯著負相關關系，本研究中3 種粗飼料在各時間點的產(chǎn)氣量由高到低為花生秧 ＞ 花生殼 ＞ 羊草，其各自的NDF 含量大小為花生殼 ＞ 羊草 ＞ 花生秧，其產(chǎn)氣量與NDF 含量趨勢相反，與前人研究結果一致。花生殼的產(chǎn)氣量低是由于木質素含量高，不易被消化利用。黃帥等[10]利用康奈爾凈碳水化合物-蛋白質體系(Cornell Net Carbohy drate and Protein System, CNCPS)計算得出花生殼不可利用的細胞壁含量高達47.94%，進一步說明了花生殼不易被微生物利用。

本研究中3 種粗飼料的理論最大產(chǎn)氣量由高到低為花生秧 ＞ 花生殼 ＞ 羊草，可能與3 種粗飼料營養(yǎng)成分的不同有關，有研究報道[25]，理論最大產(chǎn)氣量的高低與粗飼料中可溶性非結構碳水化合物與粗蛋白比例正相關。

3.2 不同粗飼料對pH 及揮發(fā)性脂肪酸的影響

pH 能夠直觀地反映瘤胃的發(fā)酵狀況，同時也是反映瘤胃內VFA 酸度的重要指標。正常情況下反芻動物瘤胃液的pH 變化范圍為5.5～7.5，當pH低于6.5 時，纖維物質的消化受到影響，當pH 低于5.5 時，則會引起酸中毒[26]。本研究中，3 種粗飼料的體外發(fā)酵液pH 在6.67～7.23，均在正常變化范圍之內，且不會影響對纖維物質的消化。揮發(fā)性脂肪酸是飼料中碳水化合物經(jīng)厭氧發(fā)酵的終產(chǎn)物，為反芻動物提供總能量的70%～80%，是維持動物自身生命活動的主要能源。瘤胃內pH 的高低與TVFA 的含量有關，TVFA 含量的增加會降低瘤胃液的pH，本研究中3 種粗飼料的pH 和TVFA的變化趨勢相反。其中花生秧的TVFA 含量和丙酸比例顯著高于花生殼和羊草，乙酸/丙酸比值最低；羊草的TVFA 含量和丙酸比例顯著低于花生秧和花生殼，乙酸/丙酸比值顯著高于花生秧和花生殼，其原因可能與飼料中碳水化合物的組成不同有關，非結構碳水化合物(nonstructural carbohydrate，NSC)含量的增加會加快瘤胃的發(fā)酵速率，使其產(chǎn)生更多的VFA，其發(fā)酵類型為丙酸型發(fā)酵，乙酸/丙酸的比值會降低[27]，黃帥等[10]計算得出花生秧的NSC 為76.86%，而羊草的NSC 僅為14.01%。研究表明，不同類型日糧對VFA 的濃度和比例有較大影響，其總量在60～150 mmol·L-1，單個酸之間的比例范圍為乙酸(40%～75%)∶丙酸(15%～40%)∶丁酸(10%～20%)[28]。本研究中，3 種粗飼料的TVFA 含量范圍為15.18～24.33 mmol·L-1，乙酸比例為46%左右，丙酸比例為23%～28%，丁酸比例為20%～25%。TVFA 含量偏低，可能與供試動物對營養(yǎng)物質的消化吸收有關；丁酸比例偏高，其原因可能是瘤胃微生物的種群差異所造成的，瘤胃中原蟲有利于丁酸的產(chǎn)生，其研究報道稱祛除原蟲可將瘤胃的發(fā)酵類型從丁酸型發(fā)酵向丙酸型發(fā)酵轉變。

表 3 3 種粗飼料體外發(fā)酵24 h 的pH 及VFA 含量Table 3 pH and VFA content of three types of roughage after 24 h of in vitro fermentation

表 4 3 種粗飼料體外發(fā)酵24 h 的氨態(tài)氮濃度及微生物蛋白含量Table 4 Ammonia nitrogen concentration and microbial protein content of three types of roughage after 24 h of in vitro fermentation

3.3 不同粗飼料對瘤胃體外發(fā)酵氨態(tài)氮濃度和微生物蛋白含量的影響

瘤胃內氨態(tài)氮濃度和微生物蛋白含量是研究瘤胃發(fā)酵的重要指標。氨態(tài)氮濃度可以綜合反映飼料中蛋白質降解與瘤胃中微生物蛋白合成之間的平衡。瘤胃微生物生長的最佳氨態(tài)氮濃度為6～9 mg·dL-1，過高或過低都不利于微生物蛋白的合成。本研究中，3 種粗飼料的氨態(tài)氮濃度范圍為6.83～12.09 mg·dL-1。羊草的氨態(tài)氮濃度過高，不利于微生物的生長。MCP 的合成離不開氨態(tài)氮，瘤胃內適宜的能氮比例會促進MCP 的合成。3 種粗飼料中花生秧的氨態(tài)氮濃度和MCP 含量均高于花生殼，說明微生物對其合成MCP 的利用率較高。羊草的氨態(tài)氮濃度最高，但MCP 含量最低，可能是瘤胃內降解產(chǎn)生的氨超過了最適范圍，過量的氨不能被微生物充分利用，從而降低了MCP的合成量。

4 結論

體外發(fā)酵24 h 后，花生秧的體外產(chǎn)氣量、TVFA、丙酸比例及MCP 含量顯著高于花生殼和羊草，pH 顯著低于花生殼和羊草。羊草的丁酸比例、乙酸/丙酸值及氨態(tài)氮濃度顯著高于花生秧和花生殼。綜合各項指標發(fā)現(xiàn)，花生秧的體外發(fā)酵效果最好，更易被瘤胃微生物利用；花生殼的纖維木質化程度高，對其進行預處理，如粉碎、氨化、青貯等可提升其營養(yǎng)價值。