林鳳，李慧敏，王玉梅，毛瑞豐

(廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，南寧 530004)

紅曲霉屬于子囊菌，能產(chǎn)生耐熱的子囊孢子，且紅曲霉能在缺氧、高酸和高鹽濃度下生存[1]。紅曲霉可用于釀酒(黃酒、果酒和藥酒)、制作發(fā)酵食品(腐乳、醬菜)、食品著色及保健品等。紅曲產(chǎn)品在亞洲地區(qū)廣為流傳，常見的為由大米發(fā)酵制成的紅曲米，簡(jiǎn)稱紅曲，其被當(dāng)做功能性食品已有數(shù)千年歷史[2]。紅曲最初被記載于《飲膳正要》，別名為赤曲、丹曲、紅米、福曲、紅大米、紅槽等?！侗静菥V目》中對(duì)其評(píng)價(jià)為“此乃人窺造化之巧者也”，“奇藥也”。此外，在《本草衍義補(bǔ)遺》、《醫(yī)林纂要》等中藥典籍中也均對(duì)紅曲有記載。

為研究紅曲米中真菌多樣性，采用以宏基因高通量測(cè)序技術(shù)為導(dǎo)向的真菌鑒定和檢測(cè)方法對(duì)廣西不同地區(qū)的紅曲米進(jìn)行檢測(cè)，探究紅曲米中真菌的群落種類、數(shù)量，獲取其多樣性信息。

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源

紅曲米：采集于廣西大瑤山不同地區(qū)。

1.2 試劑和儀器

E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒：OMEGA公司；Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒：Life公司；2×Taq Master Mix：Vazyme公司；MagicPure Size Selection DNA Beads：TransGen公司。

臺(tái)式離心機(jī) Thermo Fisher公司；漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；混勻型干式恒溫器 深圳拓能達(dá)科技有限公司；電泳儀電源、電泳槽 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司；Qubit?3.0熒光計(jì) Invitrogen公司；PCR儀 BIO-RAD公司；移液器 Eppendorf公司。

1.3 方法

高通量測(cè)序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行。

2 結(jié)果

根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)樣品中JJH和LZ的真菌種類具有較高的相似性，而LB紅曲米中真菌種類與另外2種有差異，且在3個(gè)樣品中，真菌存在的比例也不相同(見圖1)，豐度最大的為紅曲霉。

圖1 廣西不同地區(qū)紅曲米樣品真菌聚類樹及真菌豐度柱狀圖Fig.1 Fungal dendrogram and abundance histogram of Monascus samples from different regions of Guangxi

對(duì)3個(gè)紅曲樣品中檢測(cè)出的真菌進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)其中真菌主要是紅曲屬、酵母屬、曲霉屬、節(jié)擔(dān)菌屬、枝孢屬等。在39種真菌中，紫紅曲霉、Diutinamesorugosa、克魯伊假絲酵母、產(chǎn)膜畢赤酵母、Sordariomycetessp.在3個(gè)樣品中均存在，見表1和表2。

表1 3個(gè)樣品中檢出的真菌Table 1 Fungi detected from the three samples

表2 廣西不同地區(qū)紅曲米樣品中所含的真菌種類Table 2 Fungi species contained in Monascus samples from different regions of Guangxi

續(xù) 表

3 紅曲霉綜述

紅曲霉發(fā)酵的過程中，產(chǎn)生色素、莫納可林、γ-氨基丁酸(GABA)等次生代謝物，這些次生代謝物可用于食品著色劑、制作降膽固醇和降壓藥物，可見紅曲具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近幾年，對(duì)紅曲霉的研究主要集中在優(yōu)良菌株的篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化。

3.1 紅曲霉色素

食品加工通常會(huì)導(dǎo)致食品色澤的變化，因此往往需要色素來(lái)改善其不良色澤，但目前對(duì)合成色素的研究表明其具有潛在的致癌物和致突變性，且可能導(dǎo)致某些兒童疾病[3]。因此，天然色素的生產(chǎn)就顯得尤為重要。

紅曲霉色素(Monascuspigments，MP)是紅曲霉發(fā)酵的次生代謝產(chǎn)物。紅曲霉能合成31種顏色，其中最為主要的是紅色素、橙色素和黃色素，它們是苯并呋喃類混合物。目前紅色素中能明確結(jié)構(gòu)式的為紅斑胺素、紅曲紅胺素；橙色為紅斑紅曲素和紅曲紅素；黃色為紅曲素和安卡紅曲黃素[4]。

3.1.1 色素產(chǎn)量的影響因素

據(jù)報(bào)道[5]，紅曲霉色素的產(chǎn)量及質(zhì)量受環(huán)境pH值、碳源、氮源、溫度等發(fā)酵條件的影響，此外，由于色素多存在于細(xì)胞內(nèi)且色素多具有疏水性，因此色素總產(chǎn)量受細(xì)胞反饋抑制影響較大[6]。Chen Gong等[7]研究表明，細(xì)胞外色素的產(chǎn)量與菌絲形態(tài)及細(xì)胞內(nèi)顆粒狀包裹體累積有關(guān)，菌絲體較短，能產(chǎn)生較多的紅曲霉色素[8]。

3.1.2 紅曲霉色素的提取

非離子表面活性劑提取發(fā)酵是生產(chǎn)紅曲霉色素的潛在方法[9]。該方法通過分階段分批補(bǔ)料方式，增加紅曲霉色素的產(chǎn)量。第一階段收集發(fā)酵的全細(xì)胞，第二階段將全細(xì)胞作為生物催化劑來(lái)提取發(fā)酵生產(chǎn)色素。該過程利用的是非離子表面活性劑與極性弱的離子溶質(zhì)形成混合膠束的特點(diǎn)。雖然該方法深層機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，但其可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞密度高和顏料滴度高的優(yōu)點(diǎn)[10]。

3.1.3 色素合成的基因

Balakrishnan B等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，紅曲霉色素合成的關(guān)鍵基因是mppR1和MpPKS5基因簇。且有研究表明[12]，還原酶基因mppE能控制聚酮化合物途徑中橙色素向黃色素的轉(zhuǎn)變。即還原酶基因mppE控制黃色素的產(chǎn)生，當(dāng)其表達(dá)過度時(shí)，促進(jìn)黃色素的產(chǎn)生，當(dāng)使其定向失活時(shí)，橙色素和紅色素產(chǎn)量增加。此外，另一項(xiàng)研究[13]發(fā)現(xiàn)在mppE基因失活的菌株中，橙色素產(chǎn)量明顯下降，而黃色素產(chǎn)量沒有明顯改變，這表明黃色素的產(chǎn)生可能存在其他途徑。

3.2 紅曲霉代謝物的生物活性

紅曲制品對(duì)控制血膽固醇，降血壓，控制肥胖和預(yù)防癌癥的作用目前研究頗多。此外，有研究表明[14]，紅曲對(duì)骨密度和骨強(qiáng)度有增強(qiáng)作用。

莫納可林是降血脂的經(jīng)濟(jì)、有效的藥物，可由紅曲霉、土曲霉經(jīng)由固態(tài)發(fā)酵(SSF)和深層發(fā)酵(SMF)等方式產(chǎn)生[15]。3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶是膽固醇合成的關(guān)鍵限速酶，莫納可林因其與底物結(jié)構(gòu)類似而對(duì)其產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，因此作為治療高膽固醇血癥的常用藥物，且能夠降低低密度脂蛋白膽固醇含量[16]。

γ-氨基丁酸(GABA)是一種四碳的非蛋白質(zhì)的氨基酸，它是哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)，參與腦循環(huán)生理活動(dòng)。其具有降血壓、鎮(zhèn)靜安神等功能[17]。

3.3 紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的桔霉素

桔霉素[(3R，4S)-4,6-二氫-8-羥基-3,4,5-三甲基-6-氧代-3H-2-苯并吡喃-7-羧酸]，其分子結(jié)構(gòu)見圖2，是一種聚酮化合物霉菌毒素。在紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生色素的過程中，會(huì)伴隨產(chǎn)生桔霉素[18]。桔霉素熔點(diǎn)為175～178.5 ℃，難溶于冷水，微溶于熱水，可溶于氫氧化鈉、碳酸鈉、乙酸鈉及極性有機(jī)溶劑。pH 4.6時(shí)為檸檬黃針狀的固體，pH 9.9時(shí)為櫻桃紅色[19]。其產(chǎn)量主要受紅曲霉菌絲形態(tài)和呼吸速率的影響[20]。

圖2 桔霉素分子結(jié)構(gòu)Fig.2 The molecular structure of citrinin

現(xiàn)有研究表明，桔霉素對(duì)人等哺乳動(dòng)物的腎臟和肝臟有毒害作用，此外，其還具有生殖毒性、免疫毒性、致癌性且能夠?qū)е录?xì)胞凋亡[21]。但目前，對(duì)其毒性作用機(jī)理仍不明確。除其毒害作用外，也有證據(jù)表明[22]不同濃度的桔霉素對(duì)一些菌，如金黃色葡萄球菌、志賀氏痢疾桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌等有抑制作用。

3.4 桔霉素的風(fēng)險(xiǎn)控制

在工藝生產(chǎn)過程中，通過發(fā)酵工藝優(yōu)化使食品中桔霉素的含量降低到一定范圍內(nèi)，從而提高食品的安全。李玲等[23]研究表明利用微生物混合發(fā)酵法能夠從根本上防治桔霉素的產(chǎn)生。此外，在發(fā)酵過程中，添加少量脂肪酸和甲基酮不僅對(duì)色素的產(chǎn)量不產(chǎn)生影響而且可阻抑桔霉素的產(chǎn)生。陳慎等[24]則發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)桔霉素菌株用大米粉作碳源，能達(dá)到色素含量高且能控制桔霉素產(chǎn)量的目的，對(duì)于低產(chǎn)桔霉素的菌株，選擇麥芽糖作為碳源且用硫酸銨作為氮源，可達(dá)到高色素低桔霉素的目的。此外，還可通過基因工程技術(shù)敲除合成桔霉素關(guān)鍵基因pksCT[25]來(lái)構(gòu)建不產(chǎn)桔霉素且高產(chǎn)紅曲色素的菌株。

4 討論

我國(guó)主要生產(chǎn)和出口經(jīng)濟(jì)價(jià)值低的紅曲色素，而日本等國(guó)家卻主要開發(fā)經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的紅曲保健食品，因此，我國(guó)紅曲制品仍具有極大潛力。通過對(duì)紅曲米樣品中微生物多樣性分析得出不同微生物的豐度，來(lái)探索不同菌株在紅曲制品中的存在情況，為后續(xù)研究紅曲制品發(fā)酵機(jī)理提供了參考依據(jù)。目前，雖然對(duì)于紅曲霉色素生產(chǎn)代謝已在分子生物學(xué)水平上進(jìn)行了研究[26]，但利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)紅曲霉代謝機(jī)理的研究仍有空白。此外，探尋紅曲米中桔霉素的快速檢測(cè)也是重要的研究方向。而對(duì)于紅曲霉產(chǎn)桔霉素的研究多局限于限制或阻止其產(chǎn)生，且主要研究其毒理作用。雖然桔霉素分子結(jié)構(gòu)中具有活性O(shè)H基團(tuán)[27]，但目前有關(guān)桔霉素生物活性及作用機(jī)制的研究仍處于模糊階段。因此，需要更多的研究來(lái)闡明紅曲霉代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)和作用機(jī)制及其潛在的有益或有害作用。