王炳華，嚴(yán)利強(qiáng)，胡建國

(1.浙江商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 旅游烹飪學(xué)院，杭州 310053;2.浙江旅游職業(yè)學(xué)院，杭州 311231；3.濟(jì)南大學(xué)，濟(jì)南 250002)

魚露，又稱魚醬油、胰油，膠東稱為魚湯，福建稱為蝦油，是一種咸鮮味的調(diào)味品，目前廣泛應(yīng)用于中餐烹飪[1]。主要是利用一些低值雜魚、蝦或漁業(yè)生產(chǎn)下腳料為原材料，通過微生物發(fā)酵，分解原料中的脂肪、蛋白質(zhì)等成分，釀造而成的調(diào)味品，其色澤棕紅、咸鮮適口，在中餐烹飪中起到增鮮祛異的作用[2]。魚露中富含18種以上的氨基酸、多種有機(jī)酸和人體代謝必需的微量元素，營養(yǎng)價值較高[3]。

目前魚露的加工主要以天然發(fā)酵、低鹽發(fā)酵、內(nèi)臟發(fā)酵、外加種曲發(fā)酵和復(fù)合發(fā)酵為主。傳統(tǒng)天然發(fā)酵具有發(fā)酵周期長(一般周期為1年，發(fā)酵周期長的可以達(dá)2～3年)、含鹽量高的特點(diǎn)，但是其風(fēng)味獨(dú)特；低鹽發(fā)酵通過降低鹽含量，控制發(fā)酵溫度，實現(xiàn)縮短發(fā)酵周期的目的。晁岱秀等[4]以鳀魚為原料，采用低鹽發(fā)酵制作潮汕魚露，成品的TSN、氨基酸態(tài)氮以及氨基酸質(zhì)量濃度相對傳統(tǒng)工藝有大幅提高。內(nèi)臟發(fā)酵主要依靠添加富含酶的魚內(nèi)臟，促進(jìn)蛋白質(zhì)快速水解，縮短發(fā)酵周期。曲映紅等[5]采用智利外海莖柔魚內(nèi)臟為原料，制備的魚露品質(zhì)優(yōu)于加酶發(fā)酵的樣品。加曲發(fā)酵通過添加適宜的菌種，在發(fā)酵過程中分泌酶類物質(zhì)，加速蛋白質(zhì)水解，縮短發(fā)酵周期。陶忠[6]通過接種醬油曲發(fā)酵藍(lán)圓鲹制備魚露，成品的魚腥味和胺味弱,游離氨基酸含量上升。復(fù)合發(fā)酵主要是將常見方法結(jié)合，如趙久香[7]采用低鹽發(fā)酵與接種曲種結(jié)合方式制備魚露，成品的品質(zhì)優(yōu)良。方忠興[8]通過低鹽發(fā)酵，并添加蝦頭等下腳料速釀魚露，縮短發(fā)酵周期至80 d，改善了魚露風(fēng)味。目前對魚露的研究主要以品質(zhì)改良為主，對于其風(fēng)味物質(zhì)的研究相對較少。

鳀魚是我國黃海、東海單種魚類資源生物量最大的魚種，價格低廉，可開發(fā)利用空間較大[9]。本研究以鳀魚為原料，采用傳統(tǒng)發(fā)酵法、低鹽發(fā)酵法、兩段發(fā)酵法和復(fù)合發(fā)酵法制備魚露，通過感官品質(zhì)、揮發(fā)性成分、游離氨基酸、呈味核苷酸等指標(biāo)來分析不同發(fā)酵方式對魚露風(fēng)味物質(zhì)的影響，為相關(guān)研究提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

鳀魚：購于舟山漁港，選擇體長均勻，單體重量在20 g的鳀魚，置于密封冷藏箱運(yùn)至實驗室，冷凍備用；食鹽：市售；米曲霉3.042、木瓜蛋白酶：購于浙江匯寧生物科技有限公司；麩皮、豆粕：市售；甲醇、乙腈：均為色譜純；其他試劑：均為國產(chǎn)分析純。

BT-456A電子天平 深圳市博途電子科技有限公司；HH-501恒溫水浴鍋 常州市金壇高科儀器廠；HH-X7多功能料理機(jī) 茂名市永思達(dá)電器有限公司；DHP-9010D電熱恒溫培養(yǎng)箱 安慶潔佳儀器設(shè)備有限公司；GCMS-2010S GC-MS 聯(lián)用儀 上海硅儀生化科技有限公司；G1530N氨基酸分析儀 昆山市賽特科學(xué)儀器有限公司；K1100/F自動凱氏定氮儀 廣州市鴻洲實驗器材科技有限公司；PHS-25-01臺式酸度計 衢州艾普計量儀器有限公司；H-5424臺式高速離心機(jī) 北京博遠(yuǎn)科技公司；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī) 廣州市正恒自動化設(shè)備有限公司。

1.2 實驗設(shè)計

本實驗分別采用傳統(tǒng)發(fā)酵法、低鹽發(fā)酵法和復(fù)合發(fā)酵法制備鳀魚魚露，各種方法的制備工藝如下。

1.2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵法

將冷凍鳀魚解凍，整條從中間對切，并用蒸餾水漂洗干凈，加入30%的鹽拌勻，放入器皿中，在自然溫度下發(fā)酵14個月，發(fā)酵期間每3 d攪拌一次，將發(fā)酵成品攪拌均勻，過濾，制得魚露，將魚露在100 ℃殺菌10 min后放入冰箱(4±1) ℃冷藏備用。傳統(tǒng)發(fā)酵法魚露從舟山市普陀區(qū)天地魚露廠購買。

1.2.2 低鹽發(fā)酵法

參考周崇禪[10]的方法。

1.2.2.1 曲液制備

將米曲霉3.042接種于豆粕培養(yǎng)基中，在32 ℃環(huán)境下培養(yǎng)5 d，加入麩皮100 g、面粉30 g和水150 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，豆粕大曲制備完成。

1.2.2.2 原料處理

將冷凍鳀魚解凍并清洗干凈，沸水蒸30 min，放入多功能料理機(jī)攪打成漿。

1.2.2.3 接種發(fā)酵工藝

在魚肉中加入5倍的水，拌勻，加入胰蛋白酶2%，在50 ℃溫度下酶解6 h，再加入木瓜蛋白酶1.5%，繼續(xù)酶解3 h，酶解后通過水浴滅酶15 min，水浴溫度100 ℃。待冷卻至室溫后加入豆粕大曲2%、食鹽9%，攪拌均勻后放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在33 ℃條件下發(fā)酵25 d，發(fā)酵期間每3 d攪拌一次。將發(fā)酵成品攪拌均勻，過濾，100 ℃殺菌10 min，放入冰箱(4±1) ℃冷藏備用。

1.2.3 復(fù)合發(fā)酵法

參考張豪[11]的方法，采用前期外加曲液發(fā)酵與后期微生物發(fā)酵結(jié)合，曲液制備與原料處理同1.2.2。

1.2.3.1 前期外加曲液發(fā)酵

將處理好的魚肉加入曲液12%、鹽13%，在35 ℃環(huán)境下發(fā)酵18 d，發(fā)酵期間每3 d攪拌一次。

1.2.3.2 后期微生物發(fā)酵

在經(jīng)過前期發(fā)酵的魚肉中添加乳酸乳球菌乳亞種(L.lactissubsp.lactis)6%，在38 ℃環(huán)境下發(fā)酵6 d，發(fā)酵期間每3 d攪拌一次，此階段為有機(jī)酸發(fā)酵階段；再加入球形球擬酵母10%，在32 ℃環(huán)境下發(fā)酵3 d，此階段主要是產(chǎn)脂產(chǎn)香，將發(fā)酵成品攪拌均勻，過濾，100 ℃殺菌10 min，放入冰箱(4±1) ℃冷藏備用。

1.2.4 樣品處理

傳統(tǒng)發(fā)酵法制備的魚露含水量為(65.19±1.63)%，低鹽發(fā)酵法制備的魚露含水量為(81.41±0.83)%，復(fù)合發(fā)酵法制備的魚露含水量為(75.91±2.09)%。3種發(fā)酵方式制備的魚露含水量差異較大，要將其稀釋為相同含水量后進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)比較，以含水量最高的低鹽發(fā)酵法制備的魚露含水量為標(biāo)準(zhǔn)，傳統(tǒng)發(fā)酵法與復(fù)合發(fā)酵法兩種方法稀釋至含水量為81.41%。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 理化指標(biāo)檢測

總氮的測定依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 609-2018《化學(xué)試劑總氮量測定通用方法》；氨基酸態(tài)氮的測定參考熊文飛等[12]的方法；短肽的測定參考朱瀛等[13]的方法；TVB-N的測定參考李銳等[14]的方法；pH值的測定參考胡肇?zé)@等[15]的方法。

1.3.2 感官評價

3種發(fā)酵方法制備的魚露感官評定方法采用5分制，分別從鮮味、腥異味、咸味、回味感、醇厚度、酸味6個指標(biāo)進(jìn)行評價，每個指標(biāo)總分5分，每項評分去掉最高分與最低分取平均分。感官評定人員由16人組成，均具有食品專業(yè)背景，男女各半，年齡在18～22歲，在感官評定前針對魚露感官評價特點(diǎn)進(jìn)行培訓(xùn)，并禁煙酒以及刺激性食物24 h[16]。具體評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria

1.3.3 魚露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

參考肖宏艷等[17]與王悅齊等[18]的方法，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)。

GC-MS檢測條件：色譜柱為毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；起始溫度為50 ℃，以5 ℃/min的速率升溫至230 ℃，檢測溫度為240 ℃，載氣為氦氣，載氣流速為1.5 mL/min；電離方式：EI，電子能量：70 eV，質(zhì)量掃描范圍：35～245 amu。

1.3.4 魚露游離氨基酸含量測定

參考張慧林等[19]與李銳等[20]的方法，按照GB/T 5009.39-2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

樣品測定3次，使用Origin 8.0和Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法制備魚露理化指標(biāo)檢測結(jié)果

表2 魚露理化指標(biāo)檢測結(jié)果Table 2 Test results of physicochemical indicators of fish sauce

3種方法制備的魚露中總氮、氨基酸態(tài)氮、短肽、TVB-N和pH值是影響成品風(fēng)味的重要指標(biāo)。總氮主要是蛋白質(zhì)類氮以及非蛋白質(zhì)類氮分解的產(chǎn)物，由表2可知，3種方法制備的魚露總氮含量均達(dá)到魚露品質(zhì)的一級標(biāo)準(zhǔn)。其中傳統(tǒng)發(fā)酵法總氮含量最高，其次為復(fù)合發(fā)酵法與低鹽發(fā)酵法；氨基酸態(tài)氮含量直接影響魚露的醇厚感和回味感等，含量越高，其風(fēng)味品質(zhì)越佳，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵法氨基酸態(tài)氮含量為1.52 g/dL，優(yōu)于復(fù)合發(fā)酵法1.38 g/dL，低鹽發(fā)酵法最低，為1.25 g/dL；復(fù)合發(fā)酵法與低鹽發(fā)酵法制備的魚露中短肽含量均高于傳統(tǒng)發(fā)酵法，復(fù)合發(fā)酵法短肽含量最高，達(dá)到了2.11 g/dL，主要是其添加了曲液與微生物，能有效地分解蛋白質(zhì)，起到了快速發(fā)酵的作用；復(fù)合發(fā)酵法與低鹽發(fā)酵法制備的魚露中TVB-N低于傳統(tǒng)發(fā)酵方式，說明添加曲液與微生物在一定程度上能抑制腐敗微生物的繁殖；pH值偏高說明發(fā)酵過程中細(xì)菌繁殖較快，影響成品魚露的風(fēng)味，3種發(fā)酵方式制備的魚露pH值相差不顯著，對風(fēng)味影響不大。

綜合分析，傳統(tǒng)發(fā)酵法總氮、氨基酸態(tài)氮含量較高，其成品風(fēng)味物質(zhì)含量豐富；添加曲液與微生物起到了快速發(fā)酵的作用，對腐敗微生物繁殖有一定的抑制作用；3種方法制備的魚露pH值相差不顯著。

2.2 不同方法制備魚露感官評價結(jié)果分析

本研究3種發(fā)酵方法制備的魚露，通過鮮味、腥異味、咸味、回味感、醇厚度、酸味6個指標(biāo)來評價其感官特征。咸鮮味是魚露的主體味道，其主要是由鮮味物質(zhì)與咸味物質(zhì)協(xié)同呈現(xiàn)，某一種味道濃度差異都會影響其呈味效果。魚露中的鮮味物質(zhì)主要來源于發(fā)酵過程中的氨基酸和某些甜味物質(zhì)，咸味主要受鹽的添加量的影響。其他異味來源主要是在發(fā)酵過程中未完全分解的氨類物質(zhì)或發(fā)酵不徹底等因素。

由圖1可知，各指標(biāo)評分均較高，說明3種發(fā)酵方式制備的魚露感官品質(zhì)均良好。傳統(tǒng)發(fā)酵方式制備的魚露在鮮味與醇厚度兩個指標(biāo)上優(yōu)于另外兩種方法制備的魚露，主要是因為其發(fā)酵時間長，蛋白質(zhì)分解程度較高，利于風(fēng)味物質(zhì)形成；傳統(tǒng)發(fā)酵方式制備的魚露在腥異味與咸味兩個指標(biāo)上低于另外兩種方法，主要是由于傳統(tǒng)發(fā)酵方式鹽添加量較高，抑制魚自身蛋白酶活性，某些腥味物質(zhì)分解不徹底。低鹽發(fā)酵方式在發(fā)酵過程中控制了鹽的添加量，通過外加曲液加速發(fā)酵過程，其咸味指標(biāo)低于傳統(tǒng)發(fā)酵方式和復(fù)合發(fā)酵方式制備的魚露，但其在回味感、醇厚度、酸味和咸味等方面表現(xiàn)較差，主要是由于其發(fā)酵周期短，不利于風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生。復(fù)合發(fā)酵方式采用外加曲液發(fā)酵與微生物發(fā)酵結(jié)合的方式，其腥異味和酸味指標(biāo)評分較高，主要是微生物加速了蛋白質(zhì)分解，抑制了腥異味產(chǎn)生，降低了酸度。綜上所述，傳統(tǒng)發(fā)酵方式制備的魚露整體風(fēng)味最佳，其次是復(fù)合發(fā)酵方式與低鹽發(fā)酵方式制備的魚露。

圖1 感官評價結(jié)果Fig.1 Sensory evaluation results

2.3 不同方法制備的魚露主要揮發(fā)性成分比較

表3 魚露主要揮發(fā)性成分測定結(jié)果Table 3 Determination results of main volatile components in fish sauce

續(xù) 表

魚肉在制備魚露的過程中，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要是通過以下途徑形成：蛋白質(zhì)通過自身蛋白酶以及難鹽微生物作用下被分解成氨基酸及其他含氮化合物，部分氨基酸進(jìn)一步分解成揮發(fā)性脂肪酸[21]；不飽和脂肪酸和游離脂肪酸在酶的作用下或被自動降解形成揮發(fā)性醇、酮類物質(zhì)。3種發(fā)酵方式在發(fā)酵過程中，發(fā)酵時間與發(fā)酵手段的差異導(dǎo)致?lián)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異。由表3可知，從3種不同發(fā)酵方式制備的魚露中共檢測出29種風(fēng)味物質(zhì)，其中酸類6種、醇類5種、醛、酮類7種、酯類3種、含氮化合物5種、其他類3種。其中傳統(tǒng)發(fā)酵方法檢測出26種、低鹽發(fā)酵法檢測出19種、復(fù)合發(fā)酵法檢測出21種。

酸類化合物主要是甘油三酯被水解生產(chǎn)，閾值較高，對不同發(fā)酵方式制備的魚露揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)不大[22]。對比3種發(fā)酵方式，傳統(tǒng)發(fā)酵方式因發(fā)酵時間長，酸類物質(zhì)含量相對較高；低鹽發(fā)酵方式酸類物質(zhì)含量最少，主要受發(fā)酵時間與添加曲種發(fā)酵程度的影響。

醇類化合物主要來源于脂肪氧化和氨基酸等物質(zhì)代謝，閾值較低，在魚露揮發(fā)性成分中貢獻(xiàn)率較高[23]。3種發(fā)酵方式制備的魚露均含有醇類，傳統(tǒng)發(fā)酵方式除不含2-甲基-1-丙醇，含有全部被檢測出的醇類物質(zhì)，復(fù)合發(fā)酵法未檢出苯乙醇與2-甲基-1-丙醇外，低鹽發(fā)酵法未檢測出苯乙醇。醇類化合物的種類與含量是影響魚露香氣風(fēng)味的關(guān)鍵因素，其種類越豐富，含量越高，整體品質(zhì)越佳。

醛、酮類是脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，能產(chǎn)生青草、麥芽、水果等令人愉悅的氣味。其中庚醛具有魚腥味，是魚露中呈現(xiàn)腥味的主要成分，對比3種發(fā)酵方式，傳統(tǒng)發(fā)酵方式其含量最高，其次為低鹽發(fā)酵、復(fù)合發(fā)酵。主要是傳統(tǒng)發(fā)酵方式受發(fā)酵程度影響，對醛、酮類物質(zhì)分解能力較弱，低鹽發(fā)酵與復(fù)合發(fā)酵因添加曲種與微生物，有利于降低魚露中糠醛的含量，降低腥味。

酯類主要是受魚露發(fā)酵過程中醇類物質(zhì)和酸類物質(zhì)酯化反應(yīng)程度的影響。酯類物質(zhì)主要呈現(xiàn)花香、果香味道，濃度較低，增加魚露的醇厚感。傳統(tǒng)發(fā)酵方式制備的魚露酯類物質(zhì)種類和含量均優(yōu)于復(fù)合發(fā)酵方式與低鹽發(fā)酵方式。

另外，還檢測出含氮化合物以及正十二烷、十三烷等物質(zhì)成分。含氮化合物主要是炙烤味和氨味的來源，三甲胺呈現(xiàn)魚腥味。含氮化合物和其他物質(zhì)成分對魚露的整體風(fēng)味有負(fù)面影響，但是因其閾值較高，不容易被感受到。

其他呈現(xiàn)堅果味、草香、青豆香、魚香等物質(zhì)可增加魚露的回味感。

綜合分析，傳統(tǒng)發(fā)酵方式制備的魚露的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量最多，其風(fēng)味效果最佳，其次是復(fù)合發(fā)酵方式與低鹽發(fā)酵方式制備的魚露，這一結(jié)果與感官評價結(jié)果一致。

2.4 不同方法制備的魚露游離氨基酸含量

游離氨基酸是構(gòu)成不同發(fā)酵方式制備的魚露風(fēng)味物質(zhì)中重要的鮮味物質(zhì)，可以與其他風(fēng)味物質(zhì)協(xié)同，改善整體風(fēng)味，還是營養(yǎng)價值的主要指標(biāo)[24]。在魚露中，游離氨基酸的呈味效果與其含量和閾值有關(guān)。魚露風(fēng)味以咸鮮味為主，游離氨基酸中呈甜味和鮮味的氨基酸對魚露風(fēng)味的影響較大。

表4 魚露主要游離氨基酸測定結(jié)果Table 4 Determination results of main free amino acids in fish sauce mg/dL

由表4可知，3種發(fā)酵方式氨基酸總量最高的為傳統(tǒng)發(fā)酵法制備的魚露，達(dá)到4799.15 mg/dL，其次為復(fù)合發(fā)酵法制備的魚露，達(dá)到4445.36 mg/dL，最低的為低鹽發(fā)酵法，含量為4081.33 mg/dL，復(fù)合發(fā)酵法制備的魚露中必需氨基酸含量最高，其次為傳統(tǒng)發(fā)酵法和低鹽發(fā)酵法；傳統(tǒng)發(fā)酵法中的鮮味氨基酸天冬氨酸、谷氨酸與甜味氨基酸甘氨酸、丙氨酸含量比例較高，這是其感官評價較高的主要原因；3種發(fā)酵方式苦味氨基酸比例均較高，這影響鮮味的表達(dá)，但是少量苦味氨基酸可與其他呈味物質(zhì)互補(bǔ)，協(xié)調(diào)滋味，增強(qiáng)醇厚感與回味感；綜上分析，傳統(tǒng)發(fā)酵方式與復(fù)合發(fā)酵方式發(fā)酵時間較長，發(fā)酵程度較高，利于呈鮮味、甜味氨基酸的積累，減少苦味氨基酸含量，能形成咸鮮適口、回味醇厚的口味；低鹽發(fā)酵方式添加曲種，利于蛋白質(zhì)的水解，但是苦味氨基酸含量略高，對魚露風(fēng)味有一點(diǎn)兒影響。

3 結(jié)果與討論

風(fēng)味物質(zhì)的種類與含量直接影響魚露的質(zhì)量。本文通過對傳統(tǒng)發(fā)酵法、低鹽發(fā)酵法和復(fù)合發(fā)酵法生產(chǎn)的鳀魚魚露中風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行對比分析，研究結(jié)果表明：3種發(fā)酵方式制備的魚露風(fēng)味以咸鮮味為主，傳統(tǒng)發(fā)酵法制備的魚露中總氮、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、氨基酸等含量最多，其風(fēng)味醇厚，回味悠長，品質(zhì)最佳；3種發(fā)酵法制備的魚露品質(zhì)均達(dá)到了一級標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)合發(fā)酵法和低鹽發(fā)酵法在醇厚度和回味方面略差于傳統(tǒng)發(fā)酵法，但是添加曲液與微生物起到了快速發(fā)酵的作用，對腐敗微生物繁殖有一定的抑制作用；傳統(tǒng)發(fā)酵方式與復(fù)合發(fā)酵方式發(fā)酵時間較長，發(fā)酵程度較高，利于呈鮮味、甜味氨基酸的積累，減少苦味氨基酸含量，能形成咸鮮適口、回味醇厚的口味；低鹽發(fā)酵方式添加曲種，利于蛋白質(zhì)的水解，但是苦味氨基酸含量略高，對魚露的風(fēng)味有一點(diǎn)兒影響。

雖然低鹽發(fā)酵法與復(fù)合發(fā)酵法制備的魚露風(fēng)味特點(diǎn)不如傳統(tǒng)發(fā)酵法，但是在減鹽、風(fēng)味化背景下，如何篩選優(yōu)質(zhì)曲種和微生物，改良工藝，生產(chǎn)鮮味醇厚、回味悠長的魚露將成為研究新趨勢。