舒華金，吳春萱，楊 康，劉廷武，李 晨，曹傳亮

(1 南昌大學(xué)醫(yī)院，南昌 330031；2 南昌大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南昌 330006；3 南昌大學(xué) 藥學(xué)院，南昌 330031；4 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌 330006；5 南昌大學(xué) 機(jī)電工程學(xué)院，南昌 330031)

在交通事故、墜樓、醫(yī)院手術(shù)和戰(zhàn)場等情況下，失血過多是導(dǎo)致死亡最為主要的原因，因此迅速而高效地止血能夠挽救無數(shù)人的生命[1-2]。人體凝血過程分為兩步：初級止血過程和凝血級聯(lián)反應(yīng)過程，其中凝血級聯(lián)反應(yīng)過程主要是將血液轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，從而實(shí)現(xiàn)止血。因此，止血是早期傷口愈合的第一步，具有非常重要的意義。然而，在沒有止血裝置和藥劑的幫助下，尤其是在緊急情況下，靠自身凝血作用并不能實(shí)現(xiàn)及時(shí)止血。在過去的幾十年里，最為常用的止血方式是傳統(tǒng)的止血繃帶和紗布，這些止血材料在表淺傷口和低出血量的傷口中表現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢，但面對深部創(chuàng)口，傳統(tǒng)止血材料由于難以觸及和較低的吸水性往往難以起效。針對這種情況，已開發(fā)出一些可填充在深部出血點(diǎn)并引發(fā)凝血過程的沸石[3-4]、止血粉[5-6]、膠原蛋白[7-8]和殼聚糖海綿[9-10]等。但是面對大出血時(shí)，沸石不僅容易進(jìn)入毛細(xì)血管導(dǎo)致血栓形成，并且它們還具有吸水性和產(chǎn)熱的傾向，會對皮膚產(chǎn)生傷害；止血粉表現(xiàn)出弱的黏附性，容易被血液帶走；激發(fā)凝血過程的膠原或殼聚糖止血海綿在面對出血時(shí)往往需要一定時(shí)間來募集纖維蛋白和凝血因子，而且這種有機(jī)大分子物質(zhì)通常表現(xiàn)出強(qiáng)的免疫排斥反應(yīng)。因此，臨床上亟須開發(fā)新型生物相容性好且具有快速止血能力的海綿支架材料[11]。

靜電紡絲是制備多孔支架的一種綠色和常用的方法[12-13]，采用靜電紡絲法制備二氧化硅納米纖維支架因其優(yōu)異的生物相容性和有利于細(xì)胞生長等特點(diǎn)被廣泛報(bào)道，但該方法制備的二氧化硅納米纖維絲脆性較大，不能具備良好膨脹性能，限制了其應(yīng)用于止血海綿支架。海藻酸鹽敷料是一種已經(jīng)被廣泛用于傷口愈合[14]、傷口止血[9]的支架材料，表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性和止血凝血性能，但是純海藻酸鈉敷料沒有堅(jiān)韌的骨架作為支撐，強(qiáng)度低，仍未能應(yīng)用于深部大傷口止血。近年，丁斌教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了利用靜電紡絲技術(shù)與梯度冷凍法來制備高度多孔性支架的文章，具有孔率高、質(zhì)量輕、韌性大等優(yōu)勢，但并未研究其膨脹性及快速止血海綿的應(yīng)用[15]。

本研究開發(fā)出一種具有高親水性和膨脹性，良好生物相容性的二氧化硅納米纖維，并使用海藻酸鈉(ALG)包覆在納米纖維上，以提高快速膨脹性能及促凝效果，對海藻酸鈉/二氧化硅纖維復(fù)合三維支架(ALG/SiO2止血海綿)的形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。為制備出一種具有高膨脹性能快速止血性的復(fù)合傷口敷料，關(guān)鍵點(diǎn)是優(yōu)化合成材料的配方，因此，本課題組將制備得到的ALG/SiO2止血海綿進(jìn)行了鈣離子交聯(lián)，最終得到鈣離子交聯(lián)的海藻酸鹽包裹納米SiO2纖維的止血海綿(ALG/SiO2/Ca2+止血海綿)，而后對海綿的膨脹性及細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究，并采用兔股動(dòng)脈出血實(shí)驗(yàn)評估了該止血海綿的深部止血性能。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 試劑

正硅酸乙酯(TEOS)、聚乙烯醇(PVA)、磷酸、海藻酸鈉(ALG)、氯化鈣、氯化鈉、淀粉和葡萄糖均購自上海麥克林生物化學(xué)有限公司。胰酶和培養(yǎng)基(1640)購自北京索普迪奧科技有限公司。

1.2 止血海綿的制備

將10.7mL的正硅酸乙酯(TEOS)與0.042mL的磷酸溶液和10mL的超純水混合，在室溫下攪拌反應(yīng)12h后加入20mL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)的聚乙烯醇(PVA)溶液，進(jìn)一步攪拌12h，室溫陳化，制得紡絲液。然后在紡絲電壓為25kV和流速為1mL/h的條件下通過自制的靜電紡絲裝置進(jìn)行靜電紡絲，得到PVA/TEOS納米纖維，將其在800℃下進(jìn)行煅燒，制備出純的SiO2納米纖維。將0.9g的SiO2納米纖維添加到300mL 1.5%的海藻酸鈉溶液中，并在12000r/min的轉(zhuǎn)速下高速剪切30min，將所得的分散體在干冰/丙酮浴中梯度凍結(jié)后，冷凍干燥12h獲得海藻酸納包裹SiO2纖維支架(也即ALG/SiO2止血海綿)。最后將ALG/SiO2止血海綿浸泡在0.3mol/L CaCl2溶液中10min，取出后冷凍干燥48h，最終得到ALG/SiO2/Ca2+止血海綿。

1.3 材料的表征

利用SU8000型掃描電子顯微鏡對制備的SiO2納米纖維、經(jīng)海藻酸鈉和氯化鈣交聯(lián)后的海綿進(jìn)行表征，并通過EDS對所得纖維和海綿的元素含量與分布進(jìn)行測定。設(shè)計(jì)了海綿的吸水膨脹實(shí)驗(yàn)，將海綿在水中壓縮，其中V1為浸入水后海綿的體積，V0為海綿的原始體積。體積膨脹率(%)=V1/V0×100%。

1.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法評估材料的細(xì)胞毒性。在37℃ SPX-250型培養(yǎng)箱中用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基浸泡24h，得到ALG/SiO2/Ca2+止血海綿浸提液。從培養(yǎng)箱中取出已經(jīng)培養(yǎng)到一定細(xì)胞密度的L929細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以每孔3×103Cells/L的濃度接種L929細(xì)胞到96孔板后，震蕩混勻并放入培養(yǎng)箱中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，每孔加入100μL PBS洗滌細(xì)胞及100μL不同濃度的浸提液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每兩天更換一次培養(yǎng)基，在第1天，第3天，第7天提前2h加入10μL CCK-8試劑，最后用酶標(biāo)儀(吸光度：450nm)測其OD值。

1.5 死活細(xì)胞染色

從培養(yǎng)箱中取出已經(jīng)培養(yǎng)到一定細(xì)胞密度的L929細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以每孔4×103Cells/L的濃度接種L929細(xì)胞到24孔板后，震蕩混勻并放入培養(yǎng)箱中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，每孔加入100μL PBS洗滌細(xì)胞，再加入100μL不同濃度的浸提液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)的第1天，第3天，第7天時(shí)加入死活細(xì)胞染液，然后放入37℃培養(yǎng)箱孵育30min，最后在熒光顯微鏡下觀察。

1.6 體內(nèi)止血實(shí)驗(yàn)

選取6只新西蘭大白兔(南昌大學(xué)動(dòng)物中心)，分為ALG/SiO2/Ca2+止血海綿組和加壓紗布組，每組3只。手術(shù)中在左側(cè)股三角區(qū)域腹股溝內(nèi)1/3與外2/3交點(diǎn)處摸到股動(dòng)脈，觸及股動(dòng)脈搏動(dòng)后，沿動(dòng)脈行走方向做長約2cm的切口，游離股動(dòng)脈，剪斷。然后立即將止血材料壓進(jìn)創(chuàng)口內(nèi)部，并記錄相應(yīng)時(shí)刻止血效果圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiO2纖維和ALG/SiO2/Ca2+海綿的微觀結(jié)構(gòu)分析

圖1(a)是SiO2納米纖維的掃描電子顯微鏡照片，顯示了平均直徑約為200nm均勻分布的SiO2納米纖維，說明煅燒后的納米纖維表面較光滑，粗細(xì)較均勻。在SiO2納米纖維的靜電紡絲過程中可以通過控制電壓、PVA含量、流速和電導(dǎo)率得到不同直徑的納米纖維，在以往的研究中表明，提高電壓、增大電導(dǎo)率、降低流速和減小黏度可以減小納米纖維直徑，增大電導(dǎo)率可以提高納米纖維的孔隙率。圖1(b)是ALG/SiO2/Ca2+海綿的掃描電子顯微鏡照片，表明ALG/SiO2/Ca2+海綿具有高度疏松的多孔結(jié)構(gòu)，有利于海綿的止血。由圖1可知ALG/SiO2/Ca2+海綿的離子交聯(lián)過程并沒有破壞支架的多孔結(jié)構(gòu)，雖然觀察到在海綿的制備過程中部分二氧化硅納米纖維發(fā)生了斷裂，但互相交聯(lián)的海藻酸鈉彌補(bǔ)了斷裂的二氧化硅之間的連接。ALG/SiO2/Ca2+海綿的這種疏松的蜂窩狀多孔結(jié)構(gòu)用做止血海綿在快速止血方面是非常重要的，可以迅速吸收大量的傷口分泌物，從而使傷口處的血漿濃度增加，除此之外，高度親水性的多孔結(jié)構(gòu)還可以使傷口處保持濕潤狀態(tài)，有利于傷口的愈合。

圖1 SiO2納米纖維(a)和ALG/SiO2/Ca2+海綿(b)的SEM圖Fig.1 SEM images of SiO2 nanofiber (a) and ALG/SiO2/Ca2+ sponge (b)

圖2是SiO2納米纖維支架和ALG/SiO2/Ca2+復(fù)合支架的面掃描圖和元素全分析能譜圖，結(jié)果顯示支架均以SiO2納米纖維為主要骨架，其中SiO2納米纖維支架O和Si元素分布完全相同，且與掃描電鏡的形貌吻合，說明支架為純的SiO2納米纖維，元素全分析顯示除了O和Si的峰外，僅有少量的C元素，進(jìn)一步證實(shí)了支架為SiO2納米纖維支架。ALG/SiO2/Ca2+海綿的元素分析光譜(圖2(f))顯示O和Si元素分布也基本一致，說明了海藻酸鈉均勻地包裹在SiO2納米纖維表面，元素分析發(fā)現(xiàn)了C，O，Si，Cl和Ca的峰值，可推知Ca2+交聯(lián)劑成功地被負(fù)載到ALG/SiO2/Ca2+止血海綿上。

圖2 SiO2納米纖維(a),(b),(c)和ALG/SiO2/Ca2+海綿(d),(e),(f)的能量色散X射線圖譜Fig.2 EDX images of SiO2 nanofiber (a),(b)，(c) and ALG/SiO2/Ca2+ sponge (d),(e)，(f)

在深部止血過程中，海綿的吸水膨脹是海綿激發(fā)的一系列物理-生化止血過程的第一步，即通過膨脹帶來的壓力壓迫血管，達(dá)到初步止血目的。因此，海綿的吸水膨脹特性對實(shí)現(xiàn)其止血功能具有重要意義。ALG/SiO2/Ca2+海綿的溶脹性能測試實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。圖3(a)直觀展示了海綿的快速溶脹性，將壓縮后的ALG/SiO2/Ca2+海綿支架，加入水后10s內(nèi)完成膨脹過程，體積增大到原來的219%。盡管其溶脹的倍數(shù)仍有待進(jìn)一步提升，但其溶脹速率非?？?，10s內(nèi)達(dá)到最大膨脹倍數(shù)，這對于快速止血與挽救生命來說是一個(gè)相當(dāng)重要的指標(biāo)。因?yàn)橹Ъ艿目焖倥蛎浶詴Κ?dú)立的出血血管產(chǎn)生一個(gè)瞬時(shí)壓迫力，另外支架的高溶脹性也可以用于從血清中有效地吸收水分以濃聚凝血因子和紅細(xì)胞以阻止血液的流出，從而在短時(shí)間內(nèi)對傷口起到封閉作用以減少出血量。

圖3 ALG/SiO2/Ca2+海綿的溶脹性能測試結(jié)果(a)體積膨脹示意圖；(b)體積膨脹率隨時(shí)間關(guān)系曲線Fig.3 Results of water absorption expansion test of ALG/SiO2/Ca2+ sponge (a)schematic diagram of volume expansion;(b)curve of volume expansion ratio versus time

2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和死活細(xì)胞染色

生物醫(yī)學(xué)材料首先的要求就是其對人體無毒害作用[16]。采用CCK-8法和死活細(xì)胞染色來測試ALG/SiO2/Ca2+海綿對L929細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果見圖4。圖4(a)是ALG/SiO2/Ca2+海綿的細(xì)胞毒性測試結(jié)果，由圖可知吸光度值之間沒有顯著的差異。如圖4(b)所示，在第1,3,7天，細(xì)胞的數(shù)量逐漸增多并且ALG/SiO2/Ca2+海綿的浸提液并沒有對細(xì)胞產(chǎn)生任何的負(fù)面作用，說明ALG/SiO2/Ca2+海綿沒有生物毒性，并且具有較好的細(xì)胞相容性。

圖4 ALG/SiO2/Ca2+海綿的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (a)海綿浸提液對細(xì)胞增殖的影響；(b)海綿的死活細(xì)胞染色熒光顯微鏡圖(control表示用細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組)Fig.4 Cell experiment results of ALG/SiO2/Ca2+sponge(a)effect of sponge extract on cell proliferation;(b)fluorescence microscopy image of live/dead cell staining of ALG/SiO2/Ca2+ sponge (control indicates that cells cultured with cell culture medium (DMEM) is served as a control group)

2.3 體內(nèi)止血實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步貼近實(shí)際中可能的情況，如圖5所示，本課題組設(shè)計(jì)了家兔股動(dòng)脈出血實(shí)驗(yàn)以模仿實(shí)際情況中可能出現(xiàn)的大出血。手術(shù)中在左側(cè)股三角區(qū)域腹股溝內(nèi)1/3與外2/3交點(diǎn)處摸到股動(dòng)脈，觸及股動(dòng)脈搏動(dòng)后，沿動(dòng)脈行走方向做長約2cm的切口，游離股動(dòng)脈，剪斷。之后立即使用ALG/SiO2/Ca2+海綿進(jìn)行止血，對照組采用傳統(tǒng)的醫(yī)用紗布進(jìn)行止血，每組3只，以降低實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)組使用止血海綿的止血效果如圖5(d)～(f)所示，出血均可在10s內(nèi)被遏制。然而，當(dāng)用加壓紗布法進(jìn)行常規(guī)止血時(shí)(如圖5(a)～(c)所示)，無法有效止血，出血時(shí)間超過120s。ALG/SiO2/Ca2+海綿之所以可以快速止血，是因?yàn)锳LG/SiO2/Ca2+海綿能迅速從血液中吸收大量水分并且膨脹可以對出血血管產(chǎn)生一個(gè)瞬時(shí)壓迫力從而防止血液外流。同時(shí)，溶脹的海綿可在短時(shí)間內(nèi)封閉傷口，以減少出血量并降低感染風(fēng)險(xiǎn)。因此，ALG/SiO2/Ca2+海綿的溶脹膨脹特性對目前的止血支架具有重要意義。

3 結(jié)論

(1)采用靜電紡絲工藝加高溫煅燒得到二氧化硅納米纖維，并以它為骨架表面附著海藻酸鈉，然后用鈣離子交聯(lián)，通過冷凍干燥技術(shù)，最終得到結(jié)構(gòu)疏松多孔的ALG/SiO2/Ca2+海綿。

(2)ALG/SiO2/Ca2+海綿吸水膨脹性好，能在10s內(nèi)達(dá)到最大體積，且具有良好的生物相容性，在深部創(chuàng)口中能迅速吸水膨脹，壓迫血管，封閉傷口，促進(jìn)血液的快速凝結(jié)，相比傳統(tǒng)紗布止血效果明顯。

(3)基于ALG/SiO2/Ca2+海綿良好的止血效果，設(shè)想結(jié)合細(xì)胞種植或添加其他活性物質(zhì)如各種生長因子等，可以進(jìn)一步拓展其應(yīng)用范圍，為以后尋找新型止血敷料提供了新的思路。