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        益氣補腎調(diào)脂方對非酒精性脂肪性肝炎小鼠氧化應(yīng)激損傷的影響*

        2019-12-17 09:30:10楊晴柔嚴(yán)茂祥吳黎艷蔡月琴陳芝蕓
        浙江中醫(yī)雜志 2019年12期
        關(guān)鍵詞:調(diào)脂益氣肝細(xì)胞

        楊晴柔 嚴(yán)茂祥 吳黎艷 蔡月琴 陳芝蕓#

        1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

        2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心 浙江 杭州 310053

        非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD)包括肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪性肝炎(NASH)等廣泛的病理組織學(xué)異常,部分NAFLD患者可能會發(fā)展為肝硬化,最終發(fā)展為肝細(xì)胞癌[1]。盡管從肝脂肪變性發(fā)展到NASH的機制目前尚未完全闡明,但越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激是導(dǎo)致肝組織炎癥損傷的重要的機制[2],通過抗氧化應(yīng)激的干預(yù)可有效改善NAFLD的肝組織炎癥程度[3-4]。筆者在臨床上采用益氣補腎調(diào)脂方治療NAFLD病,取得良好療效。本研究旨在從氧化應(yīng)激途徑探討益氣補腎調(diào)脂方抗高脂高果糖誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝臟炎癥的作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物:50只雄性C57BL/6小鼠,SPF級,體質(zhì)量20±2g,由上海西普爾-必凱實驗物有限責(zé)任公司提供,許可證號:SCXK(滬)2013-0016;飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心。

        1.2 益氣補腎調(diào)脂方制備:黃芪、茯苓、炒白術(shù)、淫羊藿、制首烏、生山楂、郁金、桃仁、海藻按10∶5∶4∶4∶3∶8∶3∶3∶3比例,由本院中藥制劑室制成流浸膏。

        1.3 主要試劑和儀器:高脂飼料(由10%豬油、5%蛋黃粉、2%膽固醇、0.5%膽鹽以及82.5%基礎(chǔ)飼料組成)及果糖由南通特洛菲飼料科技有限公司提供;BCA蛋白定量(產(chǎn)品號:PQ0012)為杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,丙二醛(MDA,產(chǎn)品號A 003-1)、總抗氧化能力(T-AOC,產(chǎn)品號A015-1)、超氧化物歧化酶(T-SOD,產(chǎn)品號A001-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX,產(chǎn)品號A 005)試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;鼠抗8-OHdG單克隆抗體(產(chǎn)品號SC-39387)為美國SantaCruz產(chǎn)品。3D Histech數(shù)字病理切片掃描儀為匈牙利產(chǎn)品,precellys-24生物樣品均質(zhì)器為法國Bertin Technologies公司,BioTek Epoch2全波長酶標(biāo)儀為美國Bio Tek公司產(chǎn)品。

        1.4 實驗方法:50只小鼠隨機分成5組,即正常組、模型組以及中藥高、中、低劑量組,每組10只。正常組以普通飼料喂養(yǎng)并飲用水自由飲用,其余4組以高脂飼料喂養(yǎng)并20%果糖水自由飲用,連續(xù)16周;從實驗第5周起中藥高、中、低劑量組每天分別以 44.24g/(kg·d)、22.12g/(kg·d)、11.06g/(kg·d)的益氣補腎調(diào)脂方流浸膏灌胃,正常組、模型組以10ml/kg生理鹽水灌胃,均連續(xù)灌胃12周;灌胃結(jié)束次日各小鼠空腹麻醉下摘取肝組織,HE染色光鏡觀察肝組織脂肪變、炎癥情況,診斷標(biāo)準(zhǔn)參照“非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)”[5];參考Folch方法[6]測定肝組織TG、CHOL含量;比色法檢測肝組織T-AOC、GSH-PX水平;黃嘌呤氧化酶法檢測肝組織SOD水平,硫代巴比妥酸法測定MDA水平,嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進(jìn)行;免疫組織化學(xué)二步法檢測肝組織8-OHdG表達(dá),染色陽性表現(xiàn)為細(xì)胞核/漿呈棕黃色,根據(jù)陽性細(xì)胞的著色程度及著色范圍進(jìn)行半定量[7]。

        1.5 統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料采用單因素方差分析,計數(shù)資料采用非參數(shù)秩和檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝組織TG、CHOL影響:見表1。

        表1 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝臟TG、CHOL影響(-x ± s,mg/g,n=10)

        2.2 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝組織病理學(xué)的影響:正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常,模型組小鼠肝組織出現(xiàn)重度脂肪變,有大小不等的脂滴沉積,肝小葉可見程度不同的散在點狀壞死灶,并可見部分肝細(xì)胞氣球樣變;應(yīng)用不同劑量的益氣補腎調(diào)脂方干預(yù)后,小鼠肝組織脂質(zhì)沉積仍明顯,但炎細(xì)胞浸潤有不同程度減輕。見圖1。

        圖1 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝組織病理學(xué)的影響

        2.3 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝組織MDA水平、8-OHdG表達(dá)的影響:見表2。

        2.4 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝組織T-AOC、TSOD、GSH-PX活性的影響:模型組小鼠肝組織T-AOC、TSOD及GSH-PX活性均較正常組明顯降低(P<0.01);中藥高、中、低劑量組肝組織NT-AOC、T-SOD活性及中藥高、中劑量組肝組織GSH-PX活性均較模型組顯著上升(P<0.05,P<0.01)。見表3。

        表2 益氣補腎調(diào)脂方對NASH肝組織MDA含量、8-OHdG表達(dá)的影響(±s,n=10)

        表2 益氣補腎調(diào)脂方對NASH肝組織MDA含量、8-OHdG表達(dá)的影響(±s,n=10)

        注:與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01。

        分組正常組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組MDA(nmol/mgprot)1.93±0.44 5.15±0.55**3.36±0.27**△△3.74±0.69**△△3.98±0.54**△△8-OHdG(分)2.10±0.31 5.00±0.67**3.00±0.47**△△3.90±0.74**△4.10±0.74**△

        表3 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝臟T-AOC、T-SOD、GSH-PX活性的影響(±s,n=10)

        表3 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝臟T-AOC、T-SOD、GSH-PX活性的影響(±s,n=10)

        注:與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01。

        分組正常組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組T-AOC(U/mgprot)1.21±30.21 0.71±0.13**0.93±0.16**△△T-SOD(U/mgprot)131.73±30.27 79.69±19.23**113.89±21.25△△GSH-PX(酶活力單位/mgprot)168.17±19.85 102.57±18.09**137.22±15.62**△△0.90±0.20**△102.87±15.32**△124.05±19.69**△0.87±0.14**△98.22±12.02**△117.70±15.98**

        3 討論

        “二次打擊”學(xué)說是目前被大多數(shù)學(xué)者普遍接受的NAFLD發(fā)病機制,即各種因素(如遺傳因素、飲食中攝入過多脂肪和果糖等)作為一次打擊導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性及脂毒性誘導(dǎo)的線粒體異常,使肝臟對各種額外的促炎性損害更加敏感;在此基礎(chǔ)上氧化應(yīng)激和炎癥細(xì)胞因子作為二次打擊導(dǎo)致肝細(xì)胞受損,肝組織炎癥和纖維化[8]。研究表明,反應(yīng)性活性氧(ROS)產(chǎn)生的增加和繼發(fā)于肝脂質(zhì)沉積引起的抗氧化酶系統(tǒng)的損害是NASH發(fā)生發(fā)展的重要機制[9]。本研究發(fā)現(xiàn),NASH模型小鼠肝組織TG、CHOL水平增加,肝細(xì)胞大量脂滴沉積,炎癥細(xì)胞浸潤,同時肝組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量增高,代表ROS引起DNA損傷的標(biāo)志物8-OHdG表達(dá)水平增強;而TAOC下降,相關(guān)的抗氧化酶T-SOD、GSH-PX活性降低;提示脂質(zhì)在小鼠肝臟中過量堆積,ROS產(chǎn)生增加,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多,DNA損傷,而抗氧化酶活性被抑制,抗氧化能力下降,促使小鼠肝組織炎癥發(fā)生發(fā)展。

        根據(jù)NASH的臨床表現(xiàn)、體征及發(fā)病特點,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病發(fā)病多與過食肥甘厚味、起居失常、情志失調(diào),久病體虛等有關(guān),屬于本虛標(biāo)實之證,以脾腎虛損為主,痰濕瘀阻為標(biāo)。益氣補腎調(diào)脂方中黃芪、白術(shù)、茯苓益氣健脾,除濕泄?jié)?;淫羊藿、制首烏補腎壯陽益精血,合黃芪溫腎陽填腎精;生山楂、郁金、桃仁消食行氣,活血化瘀;海藻消痰利水;諸藥合用,共奏益氣健脾、補腎益肝、化痰祛瘀之功。本研究發(fā)現(xiàn),以不同劑量的益氣補腎調(diào)脂方干預(yù)高脂高果糖喂養(yǎng)的小鼠后,肝組織TG、CHOL含量較模型組明顯減少,肝臟脂肪變和炎癥等組織病理損傷不同程度減輕,同時肝組織MDA含量、8-OHdG表達(dá)水平較模型組下降,T-AOC、T-SOD、GSH-PX水平上調(diào)。研究結(jié)果提示,益氣補腎調(diào)脂方能有效改善NASH小鼠的肝臟脂肪變及炎癥程度,同時能顯著減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成,拮抗肝細(xì)胞DNA的氧化損傷,并提高肝組織抗氧化酶含量,表明益氣補腎調(diào)脂方抗高脂高糖誘導(dǎo)小鼠的肝組織炎癥作用可能與其抗氧化損傷有關(guān)。

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