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        熊膽粉對肝纖維化大鼠CD4+和CD8+T淋巴細胞的作用研究*

        2019-12-17 09:30:16陳丹丹朱肖鴻
        浙江中醫(yī)雜志 2019年12期
        關(guān)鍵詞:熊膽生產(chǎn)廠家陽性細胞

        陳丹丹 朱肖鴻

        浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

        肝纖維化(HF)是指由于各種致病因子致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生,肝內(nèi)細胞外基質(zhì)廣泛過度沉積的一種病理過程,是所有慢性肝病的病理基礎(chǔ)[1]。肝纖維化是慢性肝病的重要病理特征,是疾病發(fā)展成為肝硬化的一個必經(jīng)階段[2]。T淋巴細胞是介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答的主要免疫細胞,細胞免疫對于保持機體的正常免疫監(jiān)視、防御和調(diào)節(jié)功能,避免機體發(fā)生合并感染、惡性腫瘤、自身免疫性疾病發(fā)生有重要作用,CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞是具有不同功能的T淋巴細胞亞型,前者主要起輔助T細胞作用,后者具有殺傷T細胞效應(yīng)。肝硬化患者多存在免疫功能紊亂或免疫功能低下,當T淋巴細胞亞群比例失調(diào)時,肝硬化患者容易發(fā)生嚴重的合并感染或向惡性腫瘤轉(zhuǎn)變[3]。本實驗主要研究熊膽粉治療前后肝纖維化大鼠CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞的變化。

        1 實驗材料和儀器

        1.1 實驗材料:10g雄性SPF級F344大鼠27只,購自南方模式動物中心[生產(chǎn)許可證:SCXK(蘇)2015-0001,使用許可證:SYXK(蘇)2015-0001]。PBS:生產(chǎn)廠家Solarbio,中國北京。CD4-FITC:生產(chǎn)廠家ebioscience,11-0040-82。CD8-PE:生產(chǎn)廠家ebioscience,12-0084-80。Ficoll:生產(chǎn)廠家GE,17-5442-02。

        1.2 實驗儀器:CO2細胞培養(yǎng)箱:生產(chǎn)廠家Thermo Scientific,Waltham,USA。倒置顯微鏡:生產(chǎn)廠家Olympus,Tokyo,Japan。生物安全柜:生產(chǎn)廠家Thermo Scientific,Waltham,USA。常溫/冷凍離心機:生產(chǎn)廠家Eppendorf,Hamburg,German。移液器:生產(chǎn)廠家Eppendorf,Hamburg,German。流式細胞儀:生產(chǎn)廠家 Novocyte,451140510506。

        2 實驗方法

        2.1 實驗分組及處理方法:對照組9只:注射用生理鹽水1ml/kg連續(xù)每周3d,腹腔內(nèi)注射共4周,同時用生理鹽水2ml/d灌胃,共4周;肝纖維化模型組(模型組)9只:10g/L二甲基亞硝胺(DMN)(生理鹽水稀釋)1ml/kg連續(xù)每周3d,腹腔內(nèi)注射共4周,同時用生理鹽水2ml/d灌胃共4周;熊膽粉治療組(治療組)9只:10g/L DMN腹腔內(nèi)注射的同時用熊膽粉400mg/kg?d灌胃共4周。在第2周末和第4周末,進行細胞檢測。

        2.2 流式細胞檢測:流式細胞術(shù)檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞比例及CD4+/CD8+的比值。

        2.3 統(tǒng)計學(xué)分析:組間分析采用Student’s t test(兩組)或單因素方差分析(one-way ANOVA,兩組以上)方法。結(jié)果用平均值±標準誤差(Mean±SD)表示。P<0.05視為具有顯著差異。

        3 實驗結(jié)果

        與對照組相比,肝纖維化模型組肝組織來源的細胞群中CD4+陽性細胞的比例顯著降低(P<0.05),CD8+陽性細胞的比例顯著升高(P<0.01),CD4+/CD8+比值顯著降低(P<0.01);熊膽粉治療組肝組織來源的細胞群中CD4+陽性細胞的比例降低(P<0.05),但顯著高于肝纖維化模型組(P<0.01),CD8+陽性細胞的比例顯著升高(P<0.01),但顯著低于肝纖維化模型組(P<0.01),CD4+/CD8+比值顯著降低(P<0.01),但顯著高于肝纖維化模型組(P<0.01)。上述結(jié)果表明肝纖維化大鼠肝細胞中CD4+陽性細胞比例及CD4+/CD8+比值較正常組顯著降低,CD8+陽性細胞比例顯著升高,而熊膽粉對肝纖維化大鼠肝細胞中CD4+陽性細胞降低、CD8+陽性細胞比例的升高及CD4+/CD8+比值降低有顯著的負調(diào)控作用。見表1和圖1。

        表1 各組CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比較(±s)

        表1 各組CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比較(±s)

        注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01。

        CD4+/CD8+2.97±0.28 0.48±0.06**0.78±0.06**##組別 只數(shù)對照組 9模型組 9治療組 9 CD4+(%)50.54±4.13 31.91±0.61*38.32±1.13*##CD8+(%)17.03±0.23 66.89±6.61**49.38±4.13**##

        圖1 流式檢測CD4+和CD8+陽性細胞的比例

        4 討論

        肝硬化是多種慢性肝臟疾病的終末階段,以彌漫性肝纖維化伴異常結(jié)節(jié)形成為其形態(tài)學(xué)特征,嚴重影響人類健康。目前尚無有效的抗肝纖維的化學(xué)或生物藥物進入臨床應(yīng)用[4]。近年來,多有報道顯示中醫(yī)藥在抑制肝臟炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能及纖維組織增生,促進肝纖維化的逆轉(zhuǎn)等方面效果明顯[5-6]。浙江已故名中醫(yī)潘澄濂擅長治療肝病,將肝硬化分為積聚型和鼓脹型辨治,并總結(jié)病毒性肝炎后肝硬化的八種治法[7],頗有療效。

        熊膽為熊科動物黑熊或棕熊的干燥膽囊,是臨床常用的傳統(tǒng)名貴藥材。其味苦,性寒,歸肝、膽、心、胃經(jīng),具有清熱解毒、平肝明目、殺蟲止血之功[8]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[9-10]發(fā)現(xiàn),熊膽粉水解液中,含有去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸[11]。權(quán)明吉等[12]用DMN誘發(fā)大鼠肝纖維化,予400mg/kg熊膽粉灌胃4周,結(jié)果發(fā)現(xiàn)熊膽粉可以抑制DMN誘發(fā)大鼠肝纖維化。研究現(xiàn)已證實[12],熊膽可通過抑制肝星狀細胞激活與轉(zhuǎn)化而減輕DNM所致肝損害,抑制肝纖維化形成,進而減緩肝硬化進程。

        T淋巴細胞是一類重要的免疫細胞,T細胞的比值和絕對數(shù)發(fā)生改變被認為是免疫功能紊亂。成熟的T細胞根據(jù)CD4+、CD8+分子表達的不同,可以分為CD4+或CD8+T細胞。CD4+T細胞因為具有輔助體液免疫和細胞免疫的功能,所以被稱為輔助性T細胞。有研究表明,肝硬化患者存在免疫功能下降。本研究發(fā)現(xiàn),通過DMN誘發(fā)大鼠肝纖維化,從免疫方向研究得出,肝纖維化大鼠肝細胞中CD4+陽性細胞比例及CD4+/CD8+比值較正常組顯著降低,CD8+陽性細胞比例顯著升高。結(jié)果顯示,熊膽粉對肝纖維化大鼠肝細胞中CD4+陽性細胞降低、CD8+陽性細胞比例升高及CD4+/CD8+比值降低有顯著的負調(diào)控作用。

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