葉茂高

浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 浙江 溫州 325000

高尿酸血癥是一種因嘌呤代謝紊亂而使尿酸產(chǎn)生增多或尿酸排泄減少所致的代謝性疾病。高尿酸血癥不僅會(huì)發(fā)展成痛風(fēng)[1]，從而侵犯關(guān)節(jié)發(fā)生關(guān)節(jié)炎癥和變形，并且會(huì)損害腎臟及心血管等。高尿酸血癥還與糖尿病、高血壓病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中等疾病的發(fā)生具有密切聯(lián)系?；⒄染哂星鍩峤舛?，散瘀止痛，利濕退黃等功效。臨床發(fā)現(xiàn)其具有明顯的降尿酸作用。已知尿酸主要經(jīng)腎臟及腸道排泄，腎小管中的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在排泄尿酸過程中起主要作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，本實(shí)驗(yàn)選擇其中的幾個(gè)主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為測(cè)定指標(biāo)，以探討虎杖的降尿酸作用機(jī)理。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200±20g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk(滬)2008-0016。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：虎杖由浙江省中醫(yī)藥大學(xué)門診部制劑室提供；苯溴馬隆片（昆山龍燈瑞迪制藥有限公司）；腺嘌呤（美國(guó)Amresco公司）；氧嗪酸鉀（蘇州全輝生物科技有限公司）。

1.3 試劑：尿酸測(cè)定試劑盒、肌酐測(cè)試盒、尿素氮測(cè)試盒由德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司提供；引物（上海生工生物工程股份有限公司）；Trizol（Invitrogen）；DEPC處理水（基爾頓生物科技有限公司）；SYBR Green PCR試劑盒（Thermo）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas）；異丙醇、無水乙醇氯仿（國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司）。

1.4 主要儀器設(shè)備：低溫高速離心機(jī)（北京東南儀誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；100℃金屬浴箱（河南鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）；Real-time檢測(cè)儀（ABI公司，型號(hào)ABI-7300）；低溫冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)TG-16M）；旋渦振蕩器（青浦瀘西儀器廠，型號(hào)K30）；電動(dòng)勻漿機(jī)（FLUKO，型號(hào)PRO200）。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：SD大鼠60只以10只為1組隨機(jī)分為6組：空白組、模型組、西藥組和虎杖低劑量組、中劑量組、高劑量組。

2.2 模型建立與藥物干預(yù)：各組自由供給水與普通大鼠飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除空白組外，其余每組每日上午參照目前較為成功的高尿酸血癥造模方法，予以腹腔注射氧嗪酸鉀聯(lián)合腺嘌呤灌胃建立高尿酸血癥大鼠模型[2]。氧嗪酸鉀的劑量為200mg/kg，腺嘌呤為100mg/kg。下午除空白組外，模型組予生理鹽水10ml/kg灌胃，西藥組予苯溴馬隆11mg/kg灌胃，分別予虎杖不同劑量組虎杖低0.54g/kg、中1.08g/kg、高2.16g/kg灌胃（劑量換算根據(jù)動(dòng)物與人體的每千克體質(zhì)量劑量系數(shù)折算表，大鼠約為人的6.3倍)。連續(xù)灌胃3周。

2.3 樣本采集：在第20～21天將大鼠放入代謝籠收集24小時(shí)尿液，計(jì)24小時(shí)尿量，檢測(cè)尿液中尿酸。于第21日給藥后1小時(shí)眼眶靜脈取血，靜置30min后用離心機(jī)以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘取血清，并檢測(cè)血尿酸、血肌酐、尿素氮。

2.4 取腎組織及熒光定量PCR檢測(cè)：分述如下。

2.4.1 腎組織收集：予1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，用剪刀將老鼠腹部剪開，取腎組織，剪取腎皮質(zhì)放于無菌凍存管內(nèi)，液氮速凍2h后，置于-80℃冰箱保存。

2.4.2 引物設(shè)計(jì)：GLUT9、URAT1、OAT3引物參照文獻(xiàn)，根據(jù)大鼠基因全序列設(shè)計(jì)，并選用生物體內(nèi)恒定表達(dá)的GAPDH作為內(nèi)參，由上海生工生物工程公司合成。GAPDHPrimer F，5'-ATCACTGCCACCCAGAAG-3'，GAPDHPrimer R，5'-TCCACGACGGACACATTG-3'，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為191bps；GLUT9，Primer F，5'-TGAAACACTGGCTGCTATC-3'，GLUT9，PrimerF，5'-TGAAACACTGGCTGCTATC-3'，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為 164 bps；URAT1，5'-GAGGAACCAAGCAGGGACAAAG-3'，URAT1，PrimerF，5'-GCCGTAGAAGGTGAAGCCAAAG-3'，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為123 bps；OAT3，5′-CATCTTGCCTGGTGCCATGAC-3′，OAT3，PrimerF，5′-TACTGCTTGGGATCAGTCTCTTGTG-3′，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為105bps。

2.4.3 組織總RNA的提?。喝∧I組織放入1ml的Trizol的勻漿管中勻漿，充分裂解組織，酚氯仿法提取組織Total RNA取1μg反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，使用隨機(jī)反轉(zhuǎn)錄引物Random Primer，然后取1μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR的反應(yīng)總體系為25μl：SYBRGreen Mix 12.5μl，上游引物 F 0.5μl，下游引物 R 0.5μl，ddH2O 9.5μl，cDNA模板2μl。反應(yīng)程序：95℃，10min（95℃，15s；60℃，45s）×40；95℃,15s；60℃,1min；95℃,15s；60℃,15s；數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析：ABI Prism 7300 SDS Software。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：上述實(shí)驗(yàn)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)分析，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，各處理組間兩兩比較采用LSD-t法檢驗(yàn)。以SPSS19.0 for windows軟件進(jìn)行分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠造模前后血尿酸、腎臟指數(shù)比較：第3周末，模型組大鼠的血尿酸值、腎臟指數(shù)較空白組均有明顯升高，有顯著性差異(P＜0.01)；中藥低、中、高劑量組大鼠血尿酸值較模型組均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)過程中中藥高劑量組死亡1只，故中藥高劑量組剩余9只，其余各組大鼠無死亡。見表1。

表1 各組大鼠造模前后血尿酸值比較（±s，μmol/L）

表1 各組大鼠造模前后血尿酸值比較（±s，μmol/L）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，*P＜0.05。

第21天尿酸值111.96±12.99#333.55±65.88△159.32±62.20#*229.32±34.61#198.43±47.62#212.85±45.76△#組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組只數(shù)10 10 10 10 9 10造模前尿酸值99.36±5.06 101.88±14.14 97.71±6.64 112.41±7.04 101.50±14.49 106.71±15.48

3.2 藥物干預(yù)3周后各組大鼠血肌酐、尿素氮：第3周末，模型組大鼠的血肌酐、尿素氮水平較空白組均有明顯升高(P＜0.01)。中藥低、中、高劑量組及西藥組大鼠血肌酐水平較模型組均有下降，但經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，無顯著性差異(P＞0.05)。中藥低、中、高劑量組及西藥組較模型組大鼠尿素氮水平均有明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠干預(yù)3周后血肌酐、尿素氮比較（±s）

表2 各組大鼠干預(yù)3周后血肌酐、尿素氮比較（±s）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

尿素氮（mmol/L）5.07±0.77#11.59±2.99△8.42±1.67#8.89±1.75#7.80±0.74#8.10±1.22#組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組只數(shù)10 10 10 10 9 10血肌酐（μmol/L）51.97±3.86#63.20±8.36△60.24±4.05△62.26±4.91△56.70±2.13 59.77±5.99△

3.3 各組大鼠第3周末尿量及尿尿酸水平比較：第3周末，模型組大鼠的尿尿酸量較空白組有明顯升高，有顯著性差異(P＜0.05)；中藥低、中、高劑量組大鼠尿尿酸較模型組均有增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 第3周末各組SD大鼠尿尿酸值比較（±s）

表3 第3周末各組SD大鼠尿尿酸值比較（±s）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，*P＜0.05。

尿尿酸（μmol/L）713±54.2#1457±325△1739±418#*1746±436#*1851±309#1913±295#組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組只數(shù)10 10 10 10 9 10 24h尿量（ml）23.5±4.1#16.93±4.8△18.37±3.1#*19.74±4.6#*19.61±3.9#*20.13±4.4#

3.4 藥物干預(yù)后高尿酸血癥大鼠腎組織中尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體1(URAT1)mRNA、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體9(GLUT9)mRNA和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體3（OAT3）mRNA表達(dá)水平的比較：造模后，模型組的URAT1mRNA、GLUT9mRNA的表達(dá)比空白組明顯增強(qiáng)，而OAT3mRNA的含量明顯減少（P＜0.05）。藥物干預(yù)后，中藥虎杖低劑量組的URAT1mRNA、OAT3mRNA和中劑量組的GLUT9mRNA、OAT3mRNA，以及高劑量組URAT1mRNA、GLUT9mRNA和OAT3mRNA與模型組比較，均有顯著性差異（P＜0.05）。表明中藥虎杖對(duì)高尿酸血癥大鼠腎組織中URAT1mRNA、GLUT9mRNA表達(dá)有抑制作用，而對(duì)OAT3mRNA表達(dá)有增強(qiáng)作用。見表4。

表4 PCR檢測(cè)各組大鼠腎組織GLUT9mRNA、URAT1mRNA和OAT3mRNA表達(dá)的比較（±s）

表4 PCR檢測(cè)各組大鼠腎組織GLUT9mRNA、URAT1mRNA和OAT3mRNA表達(dá)的比較（±s）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，*P＜0.05。

2-ΔΔCt值組別空白組模型組低劑量中劑量高劑量西藥組只數(shù)10 10 10 10 9 10 OAT3mRNA 1.02±0.095#0.57±0.130△0.91±0.167#*0.89±0.167#*1.01±0.157#1.07±0.188#URAT1mRNA 0.99±0.096#1.378±0.115△1.08±0.152#*1.16±0.083*1.08±0.129#*0.94±0.113#GLUT9mRNA 0.80±0.076#0.98±0.103△0.86±0.121*0.73±0.108#*0.75±0.099#*0.96±0.117

3.5 熒光定量PCR檢測(cè)各組大鼠腎組織中GLUT9mRNA、URAT1mRNA和OAT3mRNA表達(dá)量之間的比較：第3周末，GLUT9mRNA在模型組大鼠腎組織中表達(dá)水平較空白組有明顯升高(P＜0.05)。中藥中、高劑量組大鼠較模型組大鼠的GLUT9mRNA表達(dá)水平均有明顯下降(P＜0.05)。西藥組較模型組大鼠的GLUT9mRNA表達(dá)水平均無明顯下降(P＞0.05)。中藥低、中、高劑量組大鼠較西藥組大鼠的GLUT9mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。URAT1mRNA在模型組大鼠腎組織中表達(dá)水平較空白組明顯升高(P＜0.05)。與模型組比較，中藥低、高劑量組及西藥組大鼠的URAT1mRNA表達(dá)水平均有明顯下降(P＜0.05)。西藥組大鼠較中藥中、高劑量組大鼠的URAT1mRNA表達(dá)水平降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。OAT3mRNA在模型組大鼠腎組織中表達(dá)水平較空白組明顯降低，有顯著性差異(P＜0.05)。中藥低、中、高劑量組，西藥組大鼠較模型組大鼠的OAT3mRNA表達(dá)水平均有明顯升高(P＜0.05)。西藥組大鼠較中藥低、中劑量組鼠的OAT3mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 虎杖對(duì)各組大鼠GLUT9、URAT1及OAT3mRNA表達(dá)的影響

4 討論

高尿酸血癥是嘌呤代謝異常所導(dǎo)致的代謝性疾病，其病因主要由尿酸的產(chǎn)生異常增多及尿酸的排泄減少所導(dǎo)致[1，3]。本實(shí)驗(yàn)中模型組的血尿酸水平及血肌酐與空白組對(duì)照比較可以證明高尿酸血癥大鼠模型是成功的。

中醫(yī)藥臨床治療高尿酸血癥有顯著優(yōu)勢(shì)[4]。有必要對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)中虎杖組治療血尿酸水平較模型組明顯降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明虎杖的降尿酸作用是明確的。不同劑量的虎杖組在21天治療后的血尿酸水平并不是根據(jù)虎杖藥物濃度的遞增而依次下降，可能與樣本量不夠?qū)е碌蛣┝炕⒄冉M的個(gè)別大鼠造模失敗有關(guān)。其后各組血肌酐、尿素氮及24小時(shí)尿尿酸結(jié)果均證明虎杖具有明顯的降尿酸作用，從而減少高尿酸血癥對(duì)腎臟的損害。其中低濃度虎杖組的各指標(biāo)水平均低于中劑量、高劑量虎杖組檢測(cè)結(jié)果，考慮原因同前。

尿酸主要經(jīng)腎臟及腸道排泄，其中2/3是通過腎臟排泄[1]。尿酸經(jīng)腎臟的排泄過程主要經(jīng)過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)。目前研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1[5]、OAT1、OAT3[6]等在腎臟排泄尿酸的作用中起到重要作用。近幾年發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT9也具有重吸收尿酸的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)中，相較空白組，模型組大鼠的GLUT9、URAT1的mRNA表達(dá)水平升高，OAT3的mRNA表達(dá)受到抑制，各虎杖組中的GLUT9、URAT1的mRNA表達(dá)不同程度受到抑制，OAT3的mRNA表達(dá)不同程度的提高。結(jié)果表明虎杖能通過影響腎臟的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT9、URAT1、OAT3的mRNA表達(dá)，從而起到促進(jìn)尿酸排泄的作用。