王振宇 錢 祥 張愛琴

1 浙江省杭州市丁橋醫(yī)院 浙江 杭州 310021

2 浙江省腫瘤醫(yī)院 浙江 杭州 310022

“肺與大腸相表里”是中醫(yī)學(xué)的經(jīng)典理論，筆者基于此，通過實(shí)驗(yàn)研究清肺合劑對(duì)肺癌小鼠療效及腸道菌群多樣性。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與藥品：C57BL/6小鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)條件：恒溫，溫度22±2℃，濕度50%～60%，光照每12小時(shí)明暗交替，換風(fēng)次數(shù)15～20次/小時(shí)。實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室許可證號(hào)SYXK（浙）2018-0012。清肺合劑（浙貝母、防己各41.1g，白花蛇舌草、龍葵、半枝蓮、白茅根各109.6g，重樓35.6g，仙鶴草、夏枯草各54.8g，天龍3條。浙江省腫瘤醫(yī)院采購(gòu)）。

1.2 建模與分組：小鼠LEWIS肺癌細(xì)胞置于含10%胎牛血清及高糖DMEM的完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2天更換培養(yǎng)液1次，每3天用0.25%胰酶?jìng)鞔?次。細(xì)胞匯合率達(dá)90%時(shí)收集細(xì)胞，離心去上清液加PBS吹打使細(xì)胞懸浮于PBS中，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活力測(cè)定大于95%，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×107/ml的細(xì)胞懸液備用，每只小鼠尾靜脈注射0.2ml細(xì)胞量。將小鼠尾巴上毛剃干凈，將混有Matrigel的細(xì)胞懸液用2ml針管在室溫下放置2min后注射入尾靜脈，獲得肺癌小鼠組模型。將共計(jì)48只小鼠（肺癌小鼠32只，常態(tài)小鼠16只）分為對(duì)照組（常態(tài)小鼠）、模型組及清肺合劑組各16只。A：對(duì)照組：0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC）灌胃；B：模型組：0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC）灌胃；C：清肺合劑組：0.5%羧甲基纖維素鈉+清肺合劑灌胃。

1.3 測(cè)量及活體成像：腫瘤體積用游標(biāo)卡尺測(cè)量長(zhǎng)徑和短徑，以長(zhǎng)徑×短徑×短徑/2的計(jì)算方法計(jì)算體積。

1.4 糞便DNA提取與16S rRNA PCR擴(kuò)增及Illumina測(cè)序：采集的小鼠糞便按TIANamp Stool DNA kit試劑盒說明進(jìn)行。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度及純度，1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠觀察DNA完整性。質(zhì)檢后選取合適DNA樣本進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析：采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多組計(jì)量資料采用單因素方差分析（One-Way ANOVE），組間兩兩比較方差齊性者采用T檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dun-nett’T3檢驗(yàn)。用活體成像儀在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，對(duì)小鼠腫瘤狀態(tài)進(jìn)行觀察。通過生物數(shù)據(jù)分析進(jìn)行OTU聚類及注釋、Alpha多樣性、Beta多樣性、群落組成分析、組間差異分析等。

2 結(jié)果

2.1 瘤體大小分析及活體成像：模型組腫瘤體積2416.12±396.83mm3，清肺合劑組腫瘤體積為2003.48±280.50mm3。清肺合劑組瘤徑均有一定程度減小，差異具有顯著性（P＜0.05）。說明清肺合劑對(duì)肺癌療效明確。

2.2 腸道菌群多樣性分析：分述如下。

2.2.1 OTU聚類及venn圖：OTU聚類：首先將序列完全一樣的Clean Reads根據(jù)其豐度大小進(jìn)行排序，將其中的Singletons過濾掉，利用Usearch在0.97相似度下進(jìn)行聚類，對(duì)聚類后的序列進(jìn)行嵌合體過濾后，得到用于物種分類的OTU，最后將所有Clean Reads比對(duì)到OTU序列上，將能比對(duì)上OTU的Reads提取出來，得到最終的Mapped Reads。統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品每個(gè)OTU中的豐度信息，OTU的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度。通過上述方法進(jìn)行OTU的聚類，3組小鼠共產(chǎn)生了601個(gè)OTU。如圖1所示，圖中可以看出3組之間相似的OTU占了大部分，3組共有的OTU為390個(gè)。不同組間也存在一些其特有的OTU，實(shí)驗(yàn)要尋找的肺癌關(guān)鍵菌以及清肺合劑作用靶向菌，很可能就在其中。

圖1 OTU venn圖

2.2.2 OTU PCA分析：PCA可以初步反映出不同處理或不同環(huán)境間的樣品可能表現(xiàn)出分散和聚集的分布情況，從而可以判斷相同條件的樣品組成是否具有相似性。由以下PCA分析可以看出清肺合劑組腸道菌群的組成成分與正常小鼠組更具有相似性，而肺癌組則相對(duì)來說差異較大，在一定程度上說明了清肺合劑的療效，小鼠活體成像的結(jié)果一致，見圖2。

圖2 PCA分析

2.2.3 物種豐度分析：根據(jù)物種注釋結(jié)果，對(duì)各個(gè)樣品做屬水平物種profiling相應(yīng)的柱狀圖，形成物種相對(duì)豐度柱狀圖。為了更加直觀地體現(xiàn)各組間差異，根據(jù)樣本分組信息，把各組內(nèi)數(shù)據(jù)疊加，作出三組小鼠的物種profiling柱狀圖。然后為了進(jìn)行展示，繪制了PCA圖。從圖3可以看出，清肺合劑組的腸道菌群構(gòu)成更接近正常小鼠組，與肺癌模型組具有顯著差異性，反映出清肺合劑對(duì)于肺癌小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，使之更接近正常小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)。

圖3 屬水平差異顯著物種的PCA結(jié)果展示

表1 腸道菌群組間差異性分析

我們通過組間差異分析，進(jìn)一步尋找清肺合劑起效的關(guān)鍵菌。使用秩和檢驗(yàn)的方法對(duì)不同分組之間進(jìn)行顯著性差異分析，以找出對(duì)組間劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的物種。差異分析采用R語言stats包的kruskal.test函數(shù)。通過Kruskal-Wallis test分析可以找出在不同組間有明顯差異(P＜0.05)的屬（共5個(gè)）。見表1。

3 討論

中醫(yī)學(xué)“肺與大腸相表里”闡述了肺與大腸的密切聯(lián)系，在西醫(yī)學(xué)上肺與大腸在生理及病理上也密切相關(guān)。肺部疾病能夠影響腸道菌群的種類及分布，反之腸道菌群的種類及分布也能夠影響肺部疾病的發(fā)生與發(fā)展。近年來隨著腸道菌群研究熱潮的興起，腸-肺軸（Gut-lung axis）的面紗也在一層層地被人們所揭開。清肺合劑從中醫(yī)學(xué)“肺積”切入，可以上溯到《景岳全書》，經(jīng)過我院幾代中醫(yī)工作者的多年實(shí)踐研究調(diào)整，功效清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)、活血化瘀，主要治療肺癌、放射性肺炎、咳嗽多痰、胸痛、咯血等。清肺合劑與化療、放療聯(lián)用，術(shù)后及姑息性使用，都被證實(shí)對(duì)肺癌有積極療效。清肺合劑中浙貝母、白花蛇舌草味苦性寒合而為君藥。龍葵味苦微甘性寒，清熱解毒、化痰止咳；重樓味苦性寒，清熱解毒；半枝蓮味苦性涼，清熱解毒；白茅根涼血止血；仙鶴草收斂止血；夏枯草散結(jié)消腫合而為臣藥。防己利水消腫；天龍活血散結(jié)解毒合而為佐藥。其余為使藥。

Gevers D等[1]發(fā)現(xiàn)炎癥性腸?。↖BD），克羅恩病（CD）患者腸道中Erysipelotrichaceae含量明顯低于正常值。Chen W等[2]發(fā)現(xiàn)低水平的Erysipelotrichaceae與結(jié)直腸癌密切相關(guān)，是其核心菌群。正常小鼠中Erysipelotrichaceae水平明顯高于其余兩組，肺癌可能能夠影響Erysipelotrichaceae的含量，使其顯著下降，從而致病。Dziarski R等[3]發(fā)現(xiàn)高水平的Alistipes與腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而Fenner L等[4]發(fā)現(xiàn)Alistipes還與結(jié)腸癌有明顯聯(lián)系。筆者前期實(shí)驗(yàn)也證明了Alistipes是肺癌患者與正?；颊吣c道菌群差異的關(guān)鍵致病菌。肺癌小鼠中Alistipes水平明顯高于其余兩組，肺癌可能能夠影響Alistipes，使其含量顯著增加。而清肺合劑干預(yù)組中該菌較肺癌組明顯減少，可能與清肺合劑的干預(yù)有關(guān)。Ottman N等[5]發(fā)現(xiàn)在清肺合劑干預(yù)組中明顯增多的Akkermansia具有改善代謝反應(yīng)、調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)和恢復(fù)腸道屏障功能[6]。清肺合劑干預(yù)組提高了小鼠腸道中的Akkermansia，改善代謝反應(yīng)，調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)和恢復(fù)腸道屏障功能，從而阻止了腸道中有毒有害物質(zhì)進(jìn)入肺部，并且降低了肺癌關(guān)鍵菌Alistipes的水平，抑制了腸道炎癥水平。而PCA圖也體現(xiàn)出了清肺合劑干預(yù)組的腸道菌群分布更貼近常態(tài)小鼠組，側(cè)面反應(yīng)出了清肺合劑對(duì)肺癌的作用。

通過查閱文獻(xiàn)資料，其余兩菌暫未發(fā)現(xiàn)與腸道疾病及肺部疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的特異性。Erysipelotrichaceae、Alistipes可能就是我們要找的肺癌小鼠在腸道中的關(guān)鍵菌群，肺癌能夠降低Erysipelotrichaceae的豐度，提高Alistipes的豐度，從而影響著腫瘤的發(fā)生與發(fā)展；而Akkermansia、Alistipes是清肺合劑在腸道中的靶向菌群，清肺合劑可以降低Alistipes的豐度以及提高Akkermansia的豐度，起到提高機(jī)體免疫力及抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，肺癌的發(fā)生和發(fā)展與腸道菌群有著密切聯(lián)系，而清肺合劑對(duì)于肺癌的治療也有著腸道菌群的參與。本次結(jié)果是祖國(guó)醫(yī)學(xué)在“肺與大腸相表里”理論正確性上的一個(gè)表現(xiàn)。腸道菌群作為腸道的一個(gè)重要組成部分，與肺部的主要病理疾病肺癌被證明存在著非常密切的關(guān)系。中醫(yī)學(xué)從表里經(jīng)入手，通過歸經(jīng)為大腸的藥物，對(duì)肺癌起到療效。那么能否以腸道菌群作為靶點(diǎn)，能否通過改善Erysipelotrichaceae、Alistipes豐度分布，從而影響肺癌發(fā)生發(fā)展，對(duì)肺癌起到積極的治療效果，成為肺癌防治的新靶點(diǎn)，從而為肺癌的防治提供了一個(gè)新的思路，新靶點(diǎn)和新的技術(shù)平臺(tái)，還有待實(shí)驗(yàn)的論證。