程 靜 章正祥 朱 紅 陳 強(qiáng) 唐毅華 侯 群 龔敏操 張偉駿

1 浙江省臺州市中心醫(yī)院 浙江 臺州 318001

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

3 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

偏頭痛發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，尤其對多巴胺D2受體如何在偏頭痛機(jī)制起作用仍然知之甚少。我們通過硝酸甘油誘導(dǎo)偏頭痛模型大鼠，預(yù)防給藥川芎-天麻和利扎曲普坦，用免疫組織化學(xué)漂片染色法檢測中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）腹外側(cè)邊緣多巴胺D2受體的表達(dá)，觀察偏頭痛模型大鼠三叉神經(jīng)中腦核（Vme）區(qū)域D2受體表達(dá)是否存在改變，以及川芎-天麻干預(yù)偏頭痛模型大鼠是否存在多巴胺機(jī)制改變。

1 材料

1.1 實驗動物：SPF級別SD雄性大鼠25只，購自上海西普-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0016。分籠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。

1.2 實驗藥品及試劑：硝酸甘油注射液（20150814）：北京益民藥業(yè)有限公司。苯甲酸利扎曲普坦（160403）：湖北歐立制藥有限公司。川芎配方顆粒（1603061）和天麻配方顆粒（1602112）均來自江陰天江藥業(yè)有限公司。兔抗大鼠D2多克隆抗體（GR153272-17）：德國calbiochem公司。

1.3 實驗器材及主要儀器設(shè)備：超純水儀D11931：美國BARNSTEAD公司。冰凍切片機(jī)HM550 VPD：美國Thermo SCIENTIFIC公司。-80℃超低溫冰箱702：美國Thermo SCIENTIFIC公司。-20℃冰箱MDF-U338-C：大連三洋冷鏈有限公司。病理切片掃描儀annoramic：匈牙利3DHISTECH公司。

2 實驗方法

2.1 動物準(zhǔn)備：25只健康SD雄性大鼠于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境。動物實驗遵循國家科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的要求，盡可能減少動物的痛苦。適應(yīng)性飼養(yǎng)后，體重在290～320g之間，將動物隨機(jī)分成5組，并保證了各組間體重比較無差異，分別為空白組、對照組、模型組、西藥組、中藥組，每組各5只。

2.2 藥物干預(yù)：空白組不灌胃，對照組和模型組灌胃超純水（給藥體積1ml/100g），西藥組灌胃利扎曲普坦懸濁液（給藥劑量：0.816mg/kg，給藥體積：1ml/100g)，中藥組灌胃川芎天麻配方顆粒懸濁液(川芎天麻飲片給藥劑量：3062mg/kg，給藥體積：1ml/100g，相當(dāng)于川芎：天麻=4：1）。每組連續(xù)灌胃7天，每日1次。

2.3 造模：在第7天灌胃結(jié)束后，于透明鋼化玻璃箱（長寬高30cm灌胃結(jié)束后）中適應(yīng)0.5小時后，模型組、西藥組、中藥組腹腔注射硝酸甘油（給藥劑量：10mg/kg，給藥體積：0.2ml/100g），對照組腹腔注射生理鹽水（給藥體積：0.2ml/100g），空白組不作處理。

2.4 行為學(xué)觀察：造模完成后，將大鼠放回玻璃箱中，將高清攝像機(jī)架在玻璃箱上方，保持室內(nèi)環(huán)境安靜，對所有大鼠進(jìn)行4小時行為學(xué)錄制。錄制完成后，根據(jù)錄像觀察行為，記錄下每個行為出現(xiàn)或結(jié)束的時間，并統(tǒng)計各個行為出現(xiàn)的次數(shù)。主要觀察以下2個行為學(xué)指標(biāo)：①用雙后肢站立，雙前肢無任何支撐，但并不代表身體要和箱底相垂直，身體完全伸展和不完全伸展均為站立，站立后若雙前肢觸及籠壁仍記作一次站立。②爬籠：保持直立的姿勢靠在箱壁上，包括單個前肢和雙前肢接觸箱壁，爬籠后若雙前肢離開箱壁仍記作一次爬籠。

2.5 取材及指標(biāo)測定：各組大鼠在行為學(xué)錄制后，即造模后4小時后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（給藥劑量：50mg/kg，給藥體積：0.5ml/100g），使大鼠完全麻醉后剪開兩側(cè)肋骨，止血鉗夾住胸骨下端翻轉(zhuǎn)至頭側(cè)，暴露出心臟。左手固定住心臟，右手持灌胃針頭刺入心尖，向前推進(jìn)，直至灌胃針頭部進(jìn)入主動脈。用止血鉗完全夾住整個心臟，手術(shù)剪剪破右心耳，同時止血鉗夾閉腹主動脈。注射器抽取一定量的生理鹽水，連接灌胃針頭，將液體推入主動脈，從右心耳流出，連續(xù)推注幾次，直至流出液體澄清。接著灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液，先快后慢灌注，直至上肢及頸部僵硬。固定結(jié)束后，剪開頸部皮膚，剪斷頸椎，剝離頸部和頭部兩側(cè)肌肉，用止血鉗依次剝離開頸椎、枕骨大孔、顱頂?shù)墓瞧缓箅x斷顱底神經(jīng)，取出腦組織，特別注意剝開硬腦膜。取出后，立即放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中再固定12～24h，再用4℃30%蔗糖-PBS液脫水72h，擦干表面液體，鋁箔紙包裹腦組織，標(biāo)記好分組及編號，于液氮中速凍10～15s，存于-80℃冰箱。

2.6 免疫組織化學(xué)法染色檢測多巴胺D2受體蛋白表達(dá)：分述如下。

2.6.1 切片制備：根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》(6版)對PAG腹外側(cè)邊緣的Vme進(jìn)行定位。冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為30μm，每3張取1張，每個標(biāo)本各取3張。

2.6.2 試劑配制：①取100μl山羊血清，加入900μl 0.3%的PBST中，配制成10%的山羊血清PBST溶液。②取1μl D2抗體原液加入2000μl一抗稀釋液，配制成1：2000的D2抗體稀釋液。③DAB溶液：在1ml DAB底物液中加入1滴（約50μl）DAB濃縮液，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后避光保存，6小時內(nèi)使用。

2.6.3 免疫組織化學(xué)染色（漂染法）：①切片收集于0.01M的PBS液中；②用3%的雙氧水孵育15分鐘；③PBS液漂洗3分鐘，共3次；④吸干PBS液，放入10%的山羊血清中，封閉30分鐘；⑤一抗4℃孵育48小時；⑥PBS液漂洗15分鐘，共3次；⑦加入二抗：山羊抗兔IgG/HRP聚合物，37℃孵育20分鐘；⑧PBS液漂洗10分鐘，共3次；⑨DAB溶液顯色4～5分鐘；⑩PBS液漂洗3分鐘，共3次；?貼片，37℃烘干；?85%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇梯度脫水各2min；?將中性樹膠與二甲苯以1：1的濃度均勻混合后封片。

2.6.4 圖片分析：所有切片用病理切片掃描儀掃描后，在同一放大倍數(shù)（×3.5或×20.0）進(jìn)行照片采集。每只大鼠分左右兩側(cè)各取3張含PAG腹外側(cè)邊緣區(qū)域的Vme切片，用Photoshop cs6計數(shù)工具進(jìn)行計數(shù)，三張切片合計總數(shù)，兩個人計數(shù)后取均值，并分左右進(jìn)行統(tǒng)計。三叉神經(jīng)中腦核又叫Cajal間質(zhì)核，1988年羅玉福等人按突起多寡及中樞突分叉處距胞體的遠(yuǎn)近分為ⅠA、ⅠB，ⅡA、ⅡB，ⅢA、ⅢB，ⅣA、ⅣB神經(jīng)元，其中ⅢB，ⅣA、ⅣB鄰近藍(lán)斑、藍(lán)斑下核、臂旁內(nèi)側(cè)核（MPB）和中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 25.0軟件，正態(tài)計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，左側(cè)三叉神經(jīng)中腦核D2陽性細(xì)胞個數(shù)方差不齊者，轉(zhuǎn)化為log10(L)，符合正態(tài)分布，且方差齊。各組三叉神經(jīng)中腦核D2陽性細(xì)胞個數(shù)左右比較采用配對t檢驗。采用單因素方差分析，其中兩兩比較，方差齊者采用Tukey法；各組資料均以α=0.05為顯著性水平。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)結(jié)果：造模后，對大鼠行為學(xué)錄像資料進(jìn)行觀察。對4小時視頻進(jìn)行大致觀察，我們發(fā)現(xiàn)，空白組和對照組大鼠站立和爬籠次數(shù)較多；而模型組、西藥組以及中藥組大鼠幾乎無站立和爬籠。

3.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：模型組左側(cè)多巴胺D2受體陽性細(xì)胞個數(shù)較對照組左側(cè)、空白組左側(cè)明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；與中藥組左側(cè)、西藥組左側(cè)相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。模型組右側(cè)多巴胺D2受體陽性細(xì)胞個數(shù)較對照組右側(cè)明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與其他各組右側(cè)比較，均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組三叉神經(jīng)中腦核D2陽性細(xì)胞個數(shù)左右比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 三叉神經(jīng)中腦核多巴胺D受體陽性細(xì)胞表達(dá)比較（±s）2

表1 三叉神經(jīng)中腦核多巴胺D受體陽性細(xì)胞表達(dá)比較（±s）2

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

例數(shù)組別空白組對照組模型組西藥組中藥組55555左側(cè)（個）13.10±2.61*9.60±2.13**23.40±7.83 23.20±6.34 16.00±3.79右側(cè)（個）16.40±3.27 11.60±5.63*21.10±4.23 22.20±3.07 17.90±6.26

圖1 各組大鼠免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

4 討論

本研究結(jié)果說明，多巴胺D2受體在硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛模型大鼠PAG腹外側(cè)邊緣區(qū)域的Vme中存在高表達(dá)，這與既往研究一致。Vme位于中腦和腦橋的吻側(cè)，是一個很獨特的核團(tuán)，是唯一的位于中樞內(nèi)的初級感覺神經(jīng)元，形態(tài)和功能上都與其它外周神經(jīng)節(jié)相似，其中樞突在腦干內(nèi)的投射極為廣泛，但目前對各投射區(qū)域具體執(zhí)行何種功能仍不是十分清楚。多巴胺D2受體激活誘導(dǎo)腺苷酸環(huán)化酶的抑制，伴隨著cAMP水平的快速降低，并激活K+通道和抑制Ca2+通道，最終引起細(xì)胞的超極化。本研究結(jié)果顯示硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛大鼠存在Vme中的D2受體表達(dá)增多。可以推測，一些偏頭痛的頸部僵硬和喜歡臥床休息的特點可能與Vme的多巴胺D2受體激活有關(guān)。

結(jié)合古今“頭痛”“頭風(fēng)”等相關(guān)文獻(xiàn)研究，中醫(yī)學(xué)一般認(rèn)為肝失疏泄是本病發(fā)病的病理基礎(chǔ)，風(fēng)、寒、火、痰、虛、瘀是偏頭痛的重要病機(jī)特點[1]。在治療頭痛的所有方藥中，川芎、天麻是常用藥對，該藥對也是一個方劑，即《宣明論方》的大川芎丸或《本草綱目》天麻丸,后者記載：“天麻丸消風(fēng)化痰，清利頭目，寬胸利膈。治……偏正頭痛……并宜服之。天麻半兩，川芎二兩，為末，煉蜜為丸如芡子大?！贝ㄜ?天麻比例4∶1。天麻可延長川芎中阿魏酸、川芎嗪在體內(nèi)的作用時間，川芎天麻(4∶1)組對治療血瘀型偏頭痛療效最好。

中藥組D2受體表達(dá)相比于模型組雖無統(tǒng)計學(xué)差異，但有下降趨勢，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。另外川芎配天麻常用于血瘀型和肝陽上亢型偏頭痛，但本實驗并未設(shè)置相關(guān)對照組。中藥和方劑的作用往往是多方位和復(fù)雜的，進(jìn)一步驗證與D2受體表達(dá)的關(guān)系，還需要我們增加實驗分組進(jìn)行蛋白和基因水平上的檢測，有望發(fā)現(xiàn)關(guān)于川芎-天麻治療偏頭痛多巴胺機(jī)制更為精確的結(jié)果。