肖紅梅

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科(貴州遵義 563000)

甲狀腺癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，起源于甲狀腺上皮細(xì)胞。近年來(lái)，甲狀腺癌的發(fā)病率持續(xù)增加[1]，而甲狀腺癌的治療目前主要還是以外科手術(shù)為主，放療、靶向治療以及術(shù)后內(nèi)分泌治療為輔[2-3]。臨床實(shí)踐中，手術(shù)并發(fā)癥是制約甲狀腺癌治療的一個(gè)重要因素，主要有術(shù)后出血、手術(shù)引起的喉上、喉返神經(jīng)損傷、甲狀旁腺功能衰退、感染等等[4-6]。臨床研究中發(fā)現(xiàn)提高甲狀腺癌的診斷水平，特別是對(duì)于甲狀腺癌不同組織、不同分子類型的分析對(duì)于甲狀腺癌的預(yù)后發(fā)揮重要的作用[7-9]。腫瘤標(biāo)志物是在腫瘤的診斷和預(yù)后中都發(fā)揮重要的作用，甲狀腺癌的臨床診斷標(biāo)志物有甲狀腺球蛋白、癌胚抗原以及降鈣素等，然而他們都存在特異性差的問(wèn)題[10-12]，因此開(kāi)發(fā)新的甲狀腺癌診斷標(biāo)志物具有較大的臨床意義。而芳香烴受體(AhR)是一個(gè)配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、免疫等生理活動(dòng)中發(fā)揮功能，特別是在調(diào)控藥物代謝方面發(fā)揮至關(guān)重要的功能[13-18]，而AhR在甲狀腺癌中的表達(dá)及作為甲狀腺癌腫瘤標(biāo)志物未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道。本研究于2016年9月至2019年6月開(kāi)展AhR基因在甲狀腺癌中的研究，分析其表達(dá)水平，并探索其作為甲狀腺癌診斷標(biāo)志物的能力。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 48例甲狀腺標(biāo)本采集于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院外科手術(shù)中，患者入院前未接受其他治療手段。納入標(biāo)準(zhǔn)：于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行初次單側(cè)腺葉切除術(shù)或雙側(cè)全切除術(shù)及頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)的甲狀腺癌患者，術(shù)前經(jīng)彩色超聲及細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查診斷為甲狀腺癌，并且術(shù)后組織病理確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌不納入本研究中，術(shù)后病理證實(shí)為甲狀腺良性結(jié)節(jié)也不納入本研究中。其中男27例，女21例，30周歲以下的患者有3例，30～40周歲之間的患者有25例，40～50周歲的患者有13例，50周歲以上的患者有7例?；颊咧写嬖诹馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移有23例，未轉(zhuǎn)移患者25例。腫瘤患者術(shù)后病理的病理分期(pTNM)分期Ⅰ期患者9例，Ⅱ期患者5例，Ⅲ期患者31例，Ⅳ期患者3例，pTNM分期標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)AJCC第8版進(jìn)行[19]。

1.2 材料與試劑 總RNA提取試劑TriZol，第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR熒光定量試劑盒，引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列如下：AhR的上游引物為5′-ACAT CACC TACG CCAG TCG-3′，AhR下游引物為5′-CGC TTGG AAGG ATTT GACT TGA-3′；內(nèi)參采用glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)，上游序列為5′-GGAG CGAG ATCC CTCC AAAA T-3′，下游序列為5′-GGCT GTTG TCAT ACTT CTCA TGG-3′。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的處理 甲狀腺癌標(biāo)本采集于外科切除手術(shù)中，標(biāo)本用于研究獲得患者知情同意。標(biāo)本采集完成后立即保存于超低溫冰箱中，組織的后續(xù)處理是采用機(jī)械研磨，充分裂解組織樣品。裂解的標(biāo)本組織加入總RNA提取試劑，室溫下反應(yīng)10 min，然后加入同體積氯仿，充分振蕩后室溫下靜置10 min，12 000 r/min下離心10 min，吸取上清轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，加入同體積的異丙醇溶液，充分振蕩后靜置5 min，12 000 r/min離心10 min，棄去上清，離心管底部的白色沉淀即為總RNA，75%乙醇洗滌2次后，充分干燥揮發(fā)乙醇。加入無(wú)核酸酶的去離子水，溶解RNA沉淀。得到的RNA測(cè)定濃度后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA樣品，用于后續(xù)熒光定量PCR的分析。

1.3.2 熒光定量PCR 按照試劑說(shuō)明書(shū)，按以下配方配制反應(yīng)：SYBR預(yù)混試劑10 μL，正反向引物各0.5 μL，標(biāo)本cDNA樣品加入量為100 ng，去離子水補(bǔ)齊至20 μL。冰上配制反應(yīng)體系，并注意避光。配制完成后混勻后離心，采用StepOne儀器進(jìn)行反應(yīng)。設(shè)置的程序?yàn)?，預(yù)變性2 min，95℃反應(yīng)10 s，60℃反應(yīng)30 s。循環(huán)設(shè)置為40個(gè)，程序后加引物溶解曲線程序，根據(jù)峰型來(lái)評(píng)價(jià)引物特異性，熒光定量PCR分析方法采用2-ΔCT法。

1.3.3 生物信息學(xué)分析 分析TCGA甲狀腺癌標(biāo)本數(shù)據(jù)庫(kù)，TCGA甲狀腺癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)采用生物芯片測(cè)序，基因的表達(dá)水平采用log(TPM+1)來(lái)進(jìn)行表示，TPM即為transcripts per million，計(jì)算的是某個(gè)轉(zhuǎn)錄本在一個(gè)樣品測(cè)到的所有轉(zhuǎn)錄本中所占的比例，說(shuō)明基因在樣本中的相對(duì)表達(dá)水平。運(yùn)用GEPIA在線分析工具(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)[20-21]，輸入分析基因名稱AhR，數(shù)據(jù)庫(kù)選擇甲狀腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)，其中有512例甲狀腺癌組織標(biāo)本和59例癌旁正常標(biāo)本。癌組織標(biāo)本中有BRAF樣癌組織275例，RAS樣癌組織標(biāo)本118例。而根據(jù)甲狀腺癌的病理分型，512例甲狀腺癌組織中有358例經(jīng)典型，36例高細(xì)胞型和102例濾泡型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用表示，組間差異的比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析AhR基因在甲狀腺癌中的表達(dá) 分析TCGA甲狀腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)中癌組織和正常組織中AhR的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，AhR基因在癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表1。進(jìn)一步的根據(jù)甲狀腺癌的分子分型，分析AhR基因在BRAF樣甲狀腺癌和RAS樣甲狀腺癌中的差異性表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BRAF樣甲狀腺癌癌組織中AhR基因的表達(dá)顯著高于RAS樣甲狀腺癌腫瘤組織，而且RAS樣甲狀腺癌腫瘤組織的AhR表達(dá)水平低于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 AhR在TCGA甲狀腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)中腫瘤組織和正常組織的表達(dá)水平

*與正常組織比較P<0.001；△與BRAF樣腫瘤組織比較P<0.001

2.2 AhR基因在甲狀腺癌不同組織類型中的表達(dá) AhR在36例高細(xì)胞亞型甲狀腺癌中的表達(dá)最高，高于經(jīng)典型和濾泡型甲狀腺癌，見(jiàn)表2。

表2 不同組織類型甲狀腺癌中AhR的表達(dá)水平

*與經(jīng)典型比較P<0.001

2.3 RT-PCR檢測(cè)AhR基因在48例甲狀腺癌腫瘤組織和正常組織中的差異 48例甲狀腺癌外科手術(shù)收集的腫瘤組織和癌旁組織中AhR的表達(dá)水平存在顯著的差異，AhR基因在腫瘤組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表3。其中腫瘤組織和正常組織(T/N)比值>5的有18例(37.5%)患者，而1.51.5)的患者例數(shù)為39例，約81.3%。

表3 RT-PCR分析48例甲狀腺癌腫瘤組織和正常組織中AhR的表達(dá)差異

*與正常組織比較P<0.001

2.4 ROC分析AhR作為甲狀腺癌診斷標(biāo)志物的潛力 ROC分析48例甲狀腺癌標(biāo)本顯示，AhR作為甲狀腺癌診斷標(biāo)志物，其線下面積(AUC)高達(dá)0.78(P<0.001)，約登指數(shù)最大時(shí)定義為最佳診斷值，此時(shí)AhR基因的相對(duì)表達(dá)值為0.102 4， AhR作為甲狀腺癌分子診斷標(biāo)志物的敏感度為70.83%，而特異度為83.33%。見(jiàn)圖1。

2.5 早期甲狀腺癌腫瘤組織中AhR的表達(dá)及ROC分析 48例甲狀腺癌患者中Ⅰ期9例和Ⅱ期患者5例納入早期甲狀腺癌分析中，發(fā)現(xiàn)14例早期甲狀腺癌患者腫瘤組織中AhR的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)的正常組織 (P<0.001)。而ROC曲線分析的結(jié)果顯示AhR在14例早期甲狀腺癌患者中的ROC線下面積為0.85(P<0.001)，約登指數(shù)最大時(shí)的敏感度為78.57%，特異度為92.86%，此時(shí)AhR基因表達(dá)水平的截?cái)嘀禐?.102，見(jiàn)表4和圖2。

圖1 ROC分析48例甲狀腺癌患者中AhR的診斷價(jià)值

項(xiàng)目樣本量AhR基因中位數(shù)表達(dá)水平P值腫瘤Ⅰ和Ⅱ期患者<0.000 1 腫瘤組織140.18 正常組織140.07無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者<0.000 1 腫瘤組織250.12 正常組織250.03

圖2 早期甲狀腺癌中AhR的表達(dá)及ROC分析

2.6 淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者中AhR表達(dá)水平及ROC分析 48例甲狀腺癌患者中23例患者術(shù)后病理顯示存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而25例患者未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。AhR基因在24例淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者腫瘤組織中均高于正常組織，僅有1例患者腫瘤組織中AhR的表達(dá)低于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而ROC的分析表明AhR作為淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者診斷標(biāo)志物線下診斷面積為0.75，最大約登指數(shù)時(shí)的敏感度為88%，而特異度為68%，此時(shí)AhR基因表達(dá)水平的截?cái)嘀禐?.097，見(jiàn)圖3。

圖3 淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移甲狀腺癌患者中AhR表達(dá)及ROC分析

3 討論

近年來(lái)，甲狀腺癌已經(jīng)成為頭頸部腫瘤最常見(jiàn)的惡性腫瘤，甲狀腺癌的預(yù)后較其他類型惡性腫瘤較好，得益于其較全面的腫瘤分型，為甲狀腺癌的治療提供豐富的參考。而臨床中甲狀腺癌的診斷是一大難點(diǎn)，對(duì)于甲狀腺癌和甲狀腺結(jié)節(jié)，常規(guī)的CT和MRI很難區(qū)分，而甲狀腺癌的腫瘤標(biāo)志物，如甲狀腺球蛋白、癌胚抗原以及降鈣素等，特異性較差，因此開(kāi)發(fā)新的甲狀腺癌診斷標(biāo)志物、特別是發(fā)現(xiàn)對(duì)于早期甲狀腺癌的診斷標(biāo)志物具有重要的意義。

AhR一種表達(dá)與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及藥物代謝方面發(fā)揮重要的功能。據(jù)報(bào)道，AhR介導(dǎo)多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等致癌物的促癌通路[22]，近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)AhR在乳腺癌等腫瘤中也介導(dǎo)細(xì)胞周期的調(diào)控。本研究首次探究AhR在甲狀腺癌的表達(dá)，并探索其作為甲狀腺癌診斷標(biāo)志物的潛力?；谏镄畔W(xué)的分析，我們發(fā)現(xiàn)AhR受體在甲狀腺癌的腫瘤組織中高表達(dá)，并且AhR的高表達(dá)存在組織特異性，AhR在BRAF樣甲狀腺癌中的表達(dá)顯著高于RAS樣甲狀腺癌(表1)，而B(niǎo)RAF樣甲狀腺癌和RAS樣甲狀腺癌在很多方面存在顯著的差異[23]，說(shuō)明AhR可能在甲狀腺癌不同組織類型中發(fā)揮不同的功能。腫瘤的組織類型是影響患者預(yù)后最重要的因素之一[24]，本研究分析了AhR在甲狀腺癌經(jīng)典型、高細(xì)胞亞型和濾泡型中的表達(dá)，而AhR在高細(xì)胞亞型甲狀腺癌中表達(dá)高于經(jīng)典型和濾泡型(表2)，而大量的臨床研究也發(fā)現(xiàn)高細(xì)胞亞型甲狀腺癌的預(yù)后較經(jīng)典型和濾泡型要差很多[25]，因此從這一方面來(lái)看，AhR的表達(dá)與甲狀腺癌的組織類型也存在緊密的聯(lián)系。不僅如此我們也利用收集的甲狀腺癌臨床標(biāo)本進(jìn)一步進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)AhR在甲狀腺癌腫瘤組織中顯著高表達(dá)。

AhR在甲狀腺癌腫瘤組織中高表達(dá)，那么其有可能作為甲狀腺癌的腫瘤標(biāo)志物，輔助甲狀腺癌的診斷嗎？因此我們進(jìn)一步進(jìn)行了ROC分析，發(fā)現(xiàn)AhR作為甲狀腺癌診斷標(biāo)志物，其線下面積為0.78，約登指數(shù)最大值時(shí)認(rèn)為具有是最佳截?cái)帱c(diǎn)，其敏感度為70.83%，特異度為83.33%(圖1)。而考慮甲狀腺癌早期診斷在甲狀腺癌的治療中更有應(yīng)用價(jià)值，我們分析了14例處于Ⅰ期和Ⅱ期的甲狀腺癌患者以及25例淋巴結(jié)未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移患者的AhR水平。結(jié)果表明，即使是早期甲狀腺癌患者和淋巴結(jié)未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶的患者，其腫瘤組織中AhR的水平也顯著增加(表4)，而ROC的結(jié)果也顯示其診斷線下面積分別為0.85和0.75(圖2、3)，與FNA細(xì)胞學(xué)檢查一樣，都具有較高的敏感性和特異性[26]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AhR在甲狀腺癌腫瘤組織中的表達(dá)顯著增加，并且其高表達(dá)可作為甲狀腺癌的診斷標(biāo)志物，具有較高的敏感性和特異性，即使在早期甲狀腺癌患者以及淋巴結(jié)未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者中仍然具有很高的診斷價(jià)值，在后續(xù)的研究中， AhR在不同組織類型甲狀腺癌的診斷能力值得進(jìn)一步的探究，為甲狀腺癌的診斷，特別是早期診斷和不同組織類型甲狀腺癌的診斷提供臨床參考。