邢彥，劉海寧

(青島市市立醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，青島 266000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種多起因的女性內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，典型的特征是高雄激素血癥、排卵障礙和卵巢多囊樣改變，但確切的病因很復(fù)雜，并不十分明確。Barker[1]提出了“成人疾病的胎兒起源假說”，認為生命早期在關(guān)鍵和敏感的時期受到刺激和損傷會導(dǎo)致遺傳重新編碼，從而導(dǎo)致生理和代謝的長期改變。最近的研究證明，胎兒暴露于宮內(nèi)高雄激素環(huán)境，會導(dǎo)致子代成年后出現(xiàn)PCOS樣的特征[2]。而卵巢來源的高雄激素是PCOS內(nèi)分泌紊亂的一個主要表現(xiàn)，有學(xué)者認為是卵巢局部過高的雄激素阻斷了卵泡向優(yōu)勢卵泡階段的發(fā)育[3]，從而導(dǎo)致PCOS的各種臨床表現(xiàn)。卵巢顆粒細胞P450芳香化酶(P450aroma)是將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵酶，有研究表明P450aroma mRNA在PCOS大鼠卵巢組織中的表達明顯低于對照組，并推測PCOS的發(fā)生可能與P450aroma的降低有關(guān)[4]。故本研究建立妊娠晚期暴露于高雄激素環(huán)境的大鼠動物模型，檢測子代雌鼠卵巢組織P450aroma的表達，從而探討PCOS的早期病因。

材料和方法

一、材料

1.研究對象：選用性成熟雌性Wistar大鼠20只，體重200～220 g，隨機分成實驗組和對照組，每組各10只。按照1∶1比例與雄性Wistar大鼠合籠交配，次日行陰道涂片，找到精子記為妊娠第0天。在妊娠第15～20 d，實驗組大鼠頸部皮下注射丙酸睪丸酮注射液0.6 mg，每日1次；對照組大鼠頸部皮下注射中性茶樹油0.6 mg，每日1次。待其自然分娩，留取其子代雌鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至2月齡性成熟期處死，留取卵巢組織。

2.主要試劑：PV6002試劑(北京中山金橋)；P450aroma兔抗鼠多克隆抗體(北京博奧森生物)；RNA fast200總RNA提取試劑盒(上海飛捷生物)；第一鏈合成試劑盒、HSTMTaq Mix、100 bp DNA ladder、瓊脂糖(北京東盛生物)；PCR引物(上海生物工程)。

3.主要儀器：雙目顯微鏡(Olympus，日本)；超凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)；高速離心機(GS-15R，Beckman，美國)；分光光度計(273BRO106，Bio-Rad，美國)；超低溫冰箱(SANYO，日本)；PCR擴增儀(T1 ThermocycIer，Bionetra，德國)；水平電泳儀(DYY-Ⅲ，北京六一儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)。

二、方法

1. 取材：實驗組和對照組分別產(chǎn)下雌性大鼠35只和44只。于子代雌鼠2月齡性成熟時，行4%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，取雙側(cè)卵巢組織。一側(cè)卵巢組織置于4%多聚甲醛液中固定24 h用于免疫組化檢測；另一側(cè)卵巢組織置于DEPC水處理過的EP管中，并放入-70℃冰箱保存用于RT-PCR檢測。

2. 免疫組織化學(xué)檢測P450aroma蛋白表達：運用常規(guī)免疫組織化學(xué)PV6002二步法。卵巢組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后組織切片，經(jīng)烤片、常規(guī)脫蠟脫水、水化后，滴加一抗P450aroma兔抗鼠多克隆抗體(1∶200 PBS液稀釋)，4℃冰箱過夜；PBS液沖洗4次，各1.5 min；除去PBS，滴加新鮮配制的DAB工作液(A、B、C三種液體各50 μl，加入850 μl蒸餾水，混勻)，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染5 min，1%鹽酸酒精分化30 s，氨水返藍10 min，自來水充分沖洗，烤干。以PBS代替P450aroma一抗作為陰性對照。

鏡下觀察以卵巢顆粒細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色細顆粒為P450aroma表達陽性。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Fromowitz陽性細胞半定量分級法：隨機觀察5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞。先根據(jù)陽性細胞數(shù)所占的百分數(shù)計分：<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分；再根據(jù)陽性細胞染色強度計分：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。最后根據(jù)兩者相加所得總分判定結(jié)果：0～1分(-)，2～3分(+)，4～5分(++)，6～7分(+++) 。

3. RT-PCR檢測P450aroma mRNA表達：總RNA的提取以及mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(第一鏈的合成)采用試劑盒，嚴格按照說明書操作。PCR采用10 μl反應(yīng)體系：cDNA 1.2 μl、Primer1 0.4 μl、Primer2 0.4 μl、HSTMTaq Mix 5 μl、超純水3 μl。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃充分變性5 min；94℃變性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸1 min，39個循環(huán)；72℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)，EB染色20 min，在長波紫外燈下觀察，凝膠成像系統(tǒng)照相。用Quantity one軟件分析電泳條帶進行光密度掃描，以P450aroma與內(nèi)參照β-actin電泳條帶DNA含量值之比作為評價P450aroma基因mRNA的相對表達量。PCR引物使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計，由上海生工生物有限公司合成(表1)。

表1 RT-PCR引物序列及產(chǎn)物大小

三、統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用獨立樣本t檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、免疫組化檢測結(jié)果

P450aroma蛋白在竇狀卵泡顆粒細胞、黃體和卵巢間質(zhì)中均有表達。比較卵泡顆粒細胞胞漿內(nèi)P450aroma蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，實驗組P450aroma蛋白表達顯著低于對照組(P<0.05)(表2，圖1)。

表2 P450aroma蛋白在子鼠成熟卵泡顆粒細胞中的表達

A：實驗組；B：對照組圖1 P450aroma蛋白在子鼠成熟卵泡顆粒細胞中的表達(免疫組化PV6002法，蘇木素復(fù)染，×100)

二、RT-PCR結(jié)果

實驗組與對照組卵泡顆粒細胞中P450aroma mRNA的相對表達量分別為(0.217 7±0.008 3)和(0.413 2±0.010 3)，實驗組P450aroma mRNA的相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)(表3，圖2)。

表3 P450aroma mRNA在兩組子鼠卵巢組織中的相對表達量比較(-±s)

M：100 bp DNA marker； 1.實驗組P450aroma； 2.實驗組β-actin； 3.對照組P450aroma； 4.對照組β-actin； 5.空白對照圖2 RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

討 論

大鼠為晚成雛哺乳動物，在出生前后內(nèi)生殖器和神經(jīng)系統(tǒng)對雄激素反應(yīng)敏感，故我們選擇在妊娠晚期給大鼠皮下注射丙酸睪丸酮[5]，建立宮內(nèi)高雄激素環(huán)境的動物模型，研究對子代雌鼠的影響。在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)暴露于高雄激素環(huán)境的子鼠，其表觀遺傳學(xué)發(fā)生了一些改變，包括出生體重低于對照組、出生后100 d體重高于對照組、出生后100 d乳房數(shù)低于對照組。我們的數(shù)據(jù)還發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)暴露于高雄激素環(huán)境的子鼠臍帶血睪酮濃度高于對照組，且成年后動情周期明顯少于對照組[6]。

在很多情況下，PCOS的發(fā)病具有明顯的遺傳特征，但是目前為止，對于PCOS的相關(guān)基因研究還未取得明確進展[7]。目前最流行的假說是宮內(nèi)發(fā)育胎兒過度暴露于雄激素環(huán)境可導(dǎo)致表觀遺傳改變，尤其是女性胎兒期暴露于高雄激素環(huán)境，可影響胎兒相關(guān)靶基因表達，主要與卵巢甾體激素、胰島素的合成及GnRH脈沖分泌有關(guān)[8]，與PCOS的發(fā)生關(guān)系緊密，成年后可表現(xiàn)為稀發(fā)/無排卵、高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變以及胰島素抵抗。卵巢來源的高雄激素血癥是PCOS的主要表現(xiàn)之一，Harada等[9]認為卵巢顆粒細胞中P450aroma的缺陷與高雄激素血癥有關(guān)，芳香化酶調(diào)控機制的改變是引起PCOS的原因。

細胞色素P450aroma是CYP19基因的產(chǎn)物，是將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的限速酶。芳香化酶的表達與胎兒性腺的發(fā)育、卵泡的發(fā)育密切相關(guān)[10]。近年來已有動物實驗證實PCOS患者卵巢組織中P450aroma的表達異常，可能是卵巢激素分泌紊亂，干擾卵巢正常排卵的原因，表現(xiàn)為P450aroma合成減少導(dǎo)致雄激素增高[11]。在正常情況下，雄激素是FSH誘導(dǎo)的芳香化酶的底物，低濃度的雄激素可以增強芳香化酶的活性，促進雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素。當(dāng)卵泡中雄激素水平過高時，則是促進雄激素向活性更高的5α-還原型雄激素-雙氫睪酮轉(zhuǎn)化，可刺激小卵泡生長，阻斷卵泡向優(yōu)勢卵泡階段發(fā)育成熟，從而形成卵巢多囊樣改變[12]。而已有實驗表明PCOS患者血清和羊水中睪酮濃度明顯高于對照組[13]。本實驗通過檢測孕期高雄激素環(huán)境下實驗組子代雌鼠與對照組子代雌鼠卵巢P450aroma的mRNA表達和蛋白表達，發(fā)現(xiàn)兩者在基因水平和蛋白水平均是實驗組顯著低于對照組(P<0.05)。進一步證明在卵巢發(fā)育和卵母細胞發(fā)生早期階段暴露于高雄激素環(huán)境，會導(dǎo)致子代雌鼠卵巢芳香化酶表達和合成下降，雄激素升高，進而推測是PCOS相關(guān)生殖紊亂的原因之一。還有研究表明，宮內(nèi)暴露于高雄激素環(huán)境的雌性后代可能發(fā)生非常罕見的P450aroma基因突變導(dǎo)致功能喪失，從而出現(xiàn)高雄激素血癥和卵巢多囊樣改變的表現(xiàn)[14]。

另外，胎兒某一敏感時期暴露于高雄激素環(huán)境干擾了下丘腦的Kiss1系統(tǒng)，Kisspeptin是由KISS1基因編碼、下丘腦分泌的多肽，是一種作用于GnRH上游的新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)調(diào)質(zhì)，對類固醇激素的反饋調(diào)節(jié)和代謝反應(yīng)敏感[15]。GnRH脈沖頻率增加，引起LH分泌增加、FSH分泌減少，而正常卵巢顆粒細胞內(nèi)芳香化酶是FSH誘導(dǎo)的，進而導(dǎo)致顆粒細胞內(nèi)P450aroma活性受限，雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化受限，雄激素水平增高，出現(xiàn)PCOS樣臨床表現(xiàn)[16]。

PCOS發(fā)病機制復(fù)雜，至今尚未明確。本實驗發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)暴露于高雄激素環(huán)境的子代雌鼠出生后P450aroma表達和合成下降，推測可能是導(dǎo)致PCOS的早期原因之一，進一步提示胎兒宮內(nèi)暴露于高雄激素環(huán)境可能是PCOS病因中的重要因素之一。