楊樹法，李嘉琪，劉欣，司艷梅*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，北京 100026；2.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學與發(fā)育生物學系，北京 100069)

染色體異常是出生缺陷的常見病因，預防染色體異常胎兒出生是產(chǎn)前診斷的重要內容。21-三體、18-三體、13-三體以及性染色體數(shù)目異常是常見的染色體數(shù)目異常，占產(chǎn)前診斷中染色體異常的50%以上[1]。除染色體數(shù)目異常外，染色體微缺失和微重復也是導致出生缺陷的重要原因。染色體核型分析長久以來作為染色體異常診斷的金標準，但其出具報告時間長、耗費人工以及存在不能檢出微缺失和微重復等缺點。為了克服這些缺點，近年來誕生了多種基于分子生物學的檢測方法，如免疫熒光原位雜交技術(FISH)、多重熒光聚合酶鏈反應技術(QF-PCR)等技術[2]。細菌人工染色體標記-微球鑒別分離技術(BACs-on-Beads，BoBs)能夠快速診斷上述常見染色體數(shù)目異常以及9種常見微缺失綜合征(Wolf-Hirschhorn綜合征、Cri du Chat綜合征、Williams-Beuren綜合征、Langer-Giedion綜合征、Prader-Willi/Angelman綜合征、Miller-Dieker綜合征、Smith-Magenis綜合征、DiGeorge綜合征Ⅰ型、DiGeorge綜合征Ⅱ型)[3-6]。本研究聯(lián)合BoBs和傳統(tǒng)染色體核型分析對羊水標本進行檢測，探討B(tài)oBs在快速診斷常見染色體異常中的應用。

資料與方法

一、研究對象

以2016年6月到2019年3月間在我院產(chǎn)前診斷中心進行產(chǎn)前診斷的孕婦為研究對象。入選標準：(1)具備產(chǎn)前診斷的指征；(2)同時接受染色體核型分析和BoBs檢測。排除標準：(1)染色體核型分析和BoBs檢測二者僅進行其一或同時檢測失??；(2)羊水標本為血性標本。

所有入選對象均簽署知情同意書，同意進行羊水穿刺、染色體核型分析以及BoBs檢測。研究中共收集856例患者標本，羊水穿刺指征包括唐氏篩查高風險(498/856，58.18%)、無創(chuàng)檢查高風險(198/856，23.13%)、高齡(117/856，13.67%)、B超檢查異常(18/856，2.10%)以及其他(25/856，2.92%)。

二、方法

1.染色體核型分析：B超引導下抽取30 ml羊水，分別存放于3支15 ml離心管中，兩支用于染色體核型分析。將羊水離心后的沉淀細胞接種到全羊水培養(yǎng)基(BIOAMF-2，Biological Industries，以色列)中，培養(yǎng)6～7 d后換液。培養(yǎng)瓶中克隆數(shù)量(直徑大于0.5 cm)在10個以上時，在秋水仙素作用下利用消化法制備染色體核型，經(jīng)G帶染色體后，計數(shù)25個核型并分析5個染色體核型結構，按照人類細胞基因組學國際命名體制(ISCN2016)進行命名。

2.BoBs檢測：將10 ml羊水離心取沉淀細胞，利用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，美國)試劑盒提取羊水細胞基因組DNA，按照Prenatal BACs-on-BeadsTM(Perkin Elmer，美國)試劑說明書進行樣本檢測。結合到微球上的熒光強度利用Liminex 200(Luminex，美國)進行檢測，數(shù)據(jù)分析利用BoBsoft分析軟件完成。BoBs的檢測內容如表1所示。

表1 BoBs檢測范圍

3.結果分析：依據(jù)產(chǎn)前診斷指征將孕婦進行分類，將染色體核型分析的陽性結果和BoBs陽性結果均作為陽性結果，計算得到不同指征孕婦的陽性率。按照染色體異常種類(21-三體、18-三體、13-三體、47，XXY、47，XXX、45，X、47，XYY、嵌合體、平衡易位以及微缺失/微重復)對兩種檢測方法檢測得到的陽性結果進行分類，計算每種染色體異常符合率。符合率=兩種檢測結果一致的病例數(shù)/每種染色體異常的病例數(shù)。

結 果

本研究共收集856例同時進行了染色體核型分析和BoBs檢測的孕婦資料。孕婦平均年齡為(35.23±4.36)歲。

一、不同指征孕婦陽性結果統(tǒng)計

將不同指征的孕婦資料進行分類統(tǒng)計，統(tǒng)計每種指征的陽性數(shù)量和陽性比例。856例孕婦共檢出155例染色體異常病例，總體異常率為18.11%。其中，無創(chuàng)高風險陽性比例最高(78.71%，122/198)，其它陽性率從高到低依次為B超異常(11.11%，2/18)、其它(8.11%，2/25)、高齡(5.98%，7/117)以及唐氏篩查高風險(14.19%，22/498)(表2)。

表2 不同指征孕婦陽性結果統(tǒng)計[n(%)]

二、兩種檢測方法結果比較

本研究共檢出155例染色體異常，兩種方法同時檢出141例染色體異常，包括136例染色體數(shù)目異常和5例嵌合體。BoBs檢出染色體異常146例，其中單獨檢出異常5例，為染色體微缺失和微重復；染色體核型分析檢出染色體異常150例，單獨檢出9例，包括4例嵌合體和5例平衡易位。在染色體數(shù)目異常檢出方面，BoBs和染色體核型分析的一致率為100%，對嵌合體檢測的符合率為55.56%，對平衡易位和微缺失/微重復檢測的符合率為0%(表3)。

表3 BoBs和染色體核型分析結果比較

討 論

檢出致病性染色體異常是產(chǎn)前診斷的主要內容，不同的診斷方法優(yōu)缺點各異。染色體核型分析是產(chǎn)前診斷的金標準，將BoBs與染色體核型分析進行比較可以使孕婦充分了解每種診斷方法的優(yōu)缺點，在孕婦知情同意的基礎上，幫助孕婦選擇合理的產(chǎn)前診斷方法。染色體核型分析在羊水取材過早或過晚(<15周或>24周)時，由于可生長的羊水脫落細胞數(shù)量減少，容易導致失??；而BoBs失敗主要出現(xiàn)在過早(<15周)時，由于羊水脫落細胞數(shù)量少，可提取的DNA濃度低導致。我們的研究結果表明，在常見染色體(21號、18號、13號、X以及Y染色體)數(shù)目異常的純合體檢出方面，染色體核型分析和BoBs兩者檢測的符合率為100%。在嵌合體檢出方面，兩者的符合率為55.56%，BoBs檢出效能低于染色體核型分析。BoBs技術通過特定位點探針雜交的方式測定拷貝數(shù)目的變異，不能檢出染色體平衡易位等結構性變化，在染色體結構異常檢出方面兩者的符合率為0%，BoBs僅能檢出其檢出范圍內(見表1)的染色體微缺失和微重復，而染色體核型分析能夠檢出大片段的染色體結構異常，不能檢出染色體微缺失和微重復。

一、染色體數(shù)目異常的檢出

染色體核型分析利用G顯帶方法，顯微鏡下確定染色體數(shù)量。與染色體核型分析計數(shù)染色體數(shù)目原理不同，BoBs通過待測染色體(21號、18號、13號以及性染色體)上特定位點探針雜交信號的強弱來確定染色體數(shù)目異常。其實質上利用待測染色體特定位點的拷貝數(shù)代表了整條染色體的拷貝數(shù)。多數(shù)情況下，這幾個位點的拷貝數(shù)與染色體的拷貝數(shù)相同，少數(shù)情況下也會出現(xiàn)兩者不一致的情況，利用這幾個位點代表整個染色體是存在風險的。以最常見的21-三體為例，BoBs在21號染色體的探針位置位于21q22.11-21q22.3，這是確定的唐氏綜合征的關鍵區(qū)域(Down syndrome critical region)[7]，但是一些研究表明，關鍵區(qū)域以外的21號染色體出現(xiàn)重復時，三體也會出現(xiàn)唐氏綜合征癥狀[8]，這些胎兒在用BoBs檢測時將獲得陰性結果，出生后表現(xiàn)出21-三體的癥狀。

二、嵌合體檢出

染色體核型分析是檢出染色體異常的金標準，也是國內產(chǎn)前診斷的主要方法。該方法需要培養(yǎng)、制片以及閱片等檢測過程，由于分析過程以單個中期染色體核型為單位，保留了每個細胞的染色體信息，從而保證了其對嵌合體的檢出。而BoBs檢測通過將細胞裂解提取DNA，失去了每個細胞染色體信息，通過分析整體標本的信號強度，然后根據(jù)參考值范圍判定結果，這決定了嵌合體比例在一定范圍內能夠檢出，而超出該范圍則會判定為純合，部分病例會處于灰度區(qū)間內。嵌合體斷定是BoBs在臨床應用上的主要缺點，Grati等[9]研究表明產(chǎn)前BoBs能檢出嵌合比例在30%以上的嵌合體，也就是說低比例嵌合體將被判定為染色體正常純合或染色體異常純合。國內多項研究也證實BoBs在嵌合體檢出方面與染色體核型結果不完全一致[10-12]。Cheng等[13]對BoBs和QF-PCR的研究表明，BoBs檢出嵌合體的敏感度為44.4%，QF-PCR為33.3%，BoBs檢出效能優(yōu)于QF-PCR(28.6% vs. 0%)；Choy等[14]的研究結果與之類似。

本研究中染色體核型分析檢出的9例嵌合體中有5例被BoBs檢出，兩者的符合率為55.56%；被兩種方法同時檢出的5例為真性嵌合體。另外的4例嵌合體未被BoBs檢出的原因可能是：(1)嵌合體比例小于30%；(2)培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的假性嵌合體。雖然染色體核型分析過程中將嵌合體比例定義為3%以上，以排除培養(yǎng)和制片過程中可能出現(xiàn)的假性嵌合體，但是也不能完全避免假性嵌合體。

三、染色體微缺失/微重復的檢出

BoBs能夠檢出染色體核型分析不能檢出的部分微缺失/微重復(見表1)，微缺失/微重復又稱為亞染色體拷貝數(shù)變異(sub-chromosomal copy number variations，CNVs)，可以從無癥狀(或輕中度癥狀)父母遺傳得到，也可以為新發(fā)生(de novo)。微缺失的發(fā)生率低于微重復，在胎兒的總體發(fā)生率為1.0%到1.7%之間，多數(shù)病例在孕期缺少B超可見的形態(tài)學改變[15]，是產(chǎn)前診斷中篩查的盲區(qū)，目前也缺少臨床路徑進行診斷。微缺失/微重復檢出方法包括基因組芯片、FISH、QF-PCR以及MLPA(Multiplex ligation-dependent probe amplification)等[16]，不同的方法優(yōu)缺點各異，對不同方法的適當選擇是檢出微缺失/微重復的關鍵。BoBs技術能夠檢出常見的微缺失/微重復，為產(chǎn)前階段診斷微缺失/微重復綜合征提供了很好的途徑。

與傳統(tǒng)的染色體核型分析相比，BoBs檢測技術具有快速檢測常見染色體數(shù)目異常及部分染色體微缺失/微重復、節(jié)省人工以及便于大批量操作的優(yōu)點。但BoBs利用染色體上的幾個位點代表整條染色體，存在漏診的風險；對嵌合體檢出能力較弱，并不具備對染色體整體結構評價的能力，必要時需通過FISH和核型分析的方法加以確認。僅根據(jù)BoBs檢測結果對胎兒進行進一步處理，存在較大的風險，而其與染色體核型分析聯(lián)合應用可以快速診斷某些染色畸形并且避免醫(yī)療糾紛。