周芳，王曉尉，傅龍龍，2，谷翊群,2，梁小薇，許蓬，張愛萍，溫子娜，王瑞雪，盧文紅*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，WHO人類生殖合作研究中心，國家衛(wèi)生健康委男性生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；3.沈陽東方菁華醫(yī)院，沈陽 110005；4.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)專科醫(yī)院，蘭州 730000；5. 成都西囡婦科醫(yī)院，成都 610000；6.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，長春 130021)

精液分析是評價男性生育力和檢測男性不育癥的重要手段。目前，各實(shí)驗(yàn)室精液分析檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化的程度不盡相同，內(nèi)部質(zhì)量控制和外部質(zhì)量控制制度尚不完善，使得各個實(shí)驗(yàn)室之間檢測結(jié)果的可比性較差[1]。精液分析在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部應(yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn)化程序進(jìn)行，同時必須進(jìn)行外部質(zhì)控，保證精液分析實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控制度的充分建立，確保男科診斷技術(shù)的可持續(xù)發(fā)展。雖然精液分析標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)施起來非常困難，但精液分析質(zhì)量控制是保證分析結(jié)果準(zhǔn)確的必要條件[2]。精液分析的質(zhì)量控制越來越受到行業(yè)專家和學(xué)者的重視，部分地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室也在開展精液分析質(zhì)量控制，但取得的效果并不明顯，精液分析的質(zhì)量控制需要進(jìn)一步加強(qiáng)[3-6]。在鼓勵和幫助各單位進(jìn)行內(nèi)部質(zhì)控的同時，逐步開展和完善精液分析的外部質(zhì)控。

自2011年起，國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所組織《WHO人類精液檢查和處理實(shí)驗(yàn)室手冊(第5版)》(以下簡稱WHO-5)精液分析標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)[7]，2017年我們在北京、四川、遼寧、甘肅和吉林共五個省市開展了精液分析標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)，共200多名男科、生殖中心和精子庫實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員接受了理論與手把手教授實(shí)驗(yàn)操作相結(jié)合的培訓(xùn)。因此，本研究在WHO-5標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)和內(nèi)部質(zhì)量控制的基礎(chǔ)上，在全國四省一市的精液分析實(shí)驗(yàn)室，采取集中發(fā)放標(biāo)準(zhǔn)品和集中分析的方式，根據(jù)WHO-5精液分析標(biāo)準(zhǔn)化方法，建立精子濃度、精子存活率、精子活動力和精子濃度分析的外部質(zhì)量控制網(wǎng)絡(luò)，更好地在各個精液分析實(shí)驗(yàn)室中每年進(jìn)行常規(guī)的外部質(zhì)量控制監(jiān)測，實(shí)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)室之間的可比性，完善男科診斷技術(shù)室的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化分析與建立。

資料與方法

一、研究對象

2017年在遼寧省沈陽市沈陽菁華醫(yī)院、甘肅省蘭州市蘭州大學(xué)第一醫(yī)院、四川省成都市西囡婦科醫(yī)院、吉林省長春市吉林大學(xué)第一醫(yī)院和北京市國家衛(wèi)生健康委科研所精子庫，開展精液分析的實(shí)驗(yàn)室，包括各省市三甲醫(yī)院的男科實(shí)驗(yàn)室、生殖中心實(shí)驗(yàn)室、精子庫實(shí)驗(yàn)室和臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，共106家單位。采用集中發(fā)放質(zhì)控品和現(xiàn)場評估的形式。根據(jù)WHO-5推薦的標(biāo)準(zhǔn)化方法，對參加外部質(zhì)控的所有實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員進(jìn)行培訓(xùn)。這些技術(shù)人員均為長期從事精液分析的熟練操作人員。外部質(zhì)控的內(nèi)容包括精子濃度、活動力、存活率和精子形態(tài)學(xué)分析，其中精子濃度、活動力和存活率的精液質(zhì)控品分為樣本A和樣本B，樣本A為高濃度、高活動力和高存活率的樣本；樣本B為低濃度、低活動力和低活動率的樣本。

二、精液分析所用的儀器和試劑

伊紅-苯胺黑試劑(深圳華康生物)，巴氏染色主要染液(深圳華康生物)，稀釋固定液按照WHO-5手冊配制，多人共攬顯微鏡(Nikon，日本)，普通相差顯微鏡(Nikon，日本)，改良Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(普蘭德，上海)。

三、外部質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)方法

1. 精子濃度的質(zhì)控和分析：制備精子濃度分析質(zhì)控品。在國家衛(wèi)生健康委科研所北京人類精子庫的實(shí)驗(yàn)室中，將至少兩個志愿者的新鮮精液(粘稠度正常、充分液化、無精子凝集)混合。500 μl精液分裝至1.5 ml Ep管中，每管加入10%甲醛溶液(10 μl/100 μl)混勻，于4℃保存。使用之前平衡至室溫，再次使用前充分混勻。

采用WHO-5手冊推薦的改良Neubauer計(jì)數(shù)板的方法對預(yù)先制備好的質(zhì)控品抽樣進(jìn)行精子濃度的評估，每個實(shí)驗(yàn)人員，同一樣本取樣兩次，每次至少評估200個精子。

2. 精子活動力的質(zhì)控和分析：根據(jù)WHO-5推薦的方法制備活動力濕片，用精子全自動分析儀錄制標(biāo)本視頻錄像，分別錄制相當(dāng)于若干個顯微鏡下視野的圖像。每次至少評估200個精子，保證錄像的放大倍數(shù)與實(shí)際標(biāo)本分析時顯微鏡下一致。

3.精子存活率的質(zhì)控和分析：根據(jù)WHO-5手冊推薦的方法，制備精子存活率的質(zhì)控品。分別取充分液化并混勻的高低存活率的兩份精液各50 μl，與等體積的伊紅苯胺黑溶液充分混勻后，制備精液涂片，封片備用。計(jì)數(shù)活精子的百分率。用100倍油鏡觀察，每個存活率分析精液質(zhì)控品取樣兩次，每次至少評估200個精子。

4.正常形態(tài)精子百分率的質(zhì)控和分析：根據(jù)WHO-5手冊推薦的方法，取充分液化的精液并混勻，用拉片制備精液涂片，待其完全干燥后，進(jìn)行巴氏染色，封片備用。每張涂片計(jì)數(shù)2次，每次至少評估200個精子。用多人共攬顯微鏡(Bridge Microscope)100倍油鏡觀察，分別計(jì)數(shù)出正常形態(tài)精子百分率。

5. 質(zhì)控項(xiàng)目：每個單位參加質(zhì)控的項(xiàng)目分別為：精子濃度、精子活動力、精子存活率和精子形態(tài)學(xué)評估。n代表每個地區(qū)參加外部質(zhì)控的單位數(shù)量，有些項(xiàng)目有單位尚未開展，故n在每個項(xiàng)目中不完全相同。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。n代表單位數(shù)量。分別用均數(shù)和變異系數(shù)(CV)(%)值表示各實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的變異。采用Youden圖評估各實(shí)驗(yàn)室的外部質(zhì)控結(jié)果[7]。

結(jié) 果

一、精子濃度外部質(zhì)量控制結(jié)果

1.精子濃度評估結(jié)果：僅有吉林省的各實(shí)驗(yàn)室之間樣本A和B的CV值在15%以下；北京市樣本B精子的CV值最高，為54.26%；而四川省樣本A和B的CV值均大于30%(表1)。

2.Youden圖評估各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果：分別計(jì)算樣本A和B的95%可信區(qū)間(95%CI)，并將每個地區(qū)的質(zhì)控結(jié)果制作Youden圖(圖1)。在四省一市中分別有23.53%(8/34)、25.00%(2/8)、36.84%(7/19)、10.00%(1/10)和18.18%(2/11)實(shí)驗(yàn)室的兩個質(zhì)控品均在中間的靶窗口中，即均在95%CI內(nèi)；而10.00%(1/10)、50.00%(4/8)、57.89%(11/19)、40.00%(4/10)和54.54%(6/11)實(shí)驗(yàn)室的其中一個質(zhì)控品結(jié)果在95%CI內(nèi)，另一個結(jié)果不在；其余的兩次結(jié)果均不在95%CI內(nèi)。

二、精子活動力外部質(zhì)量控制結(jié)果

1.精子活動力評估結(jié)果：四省一個直轄市的精子活動力評估結(jié)果顯示，遼寧省的樣本A和B的CV值均在10%以下；四川省樣本A的CV最大，為21.78%(表2)。

表1 精子濃度評估[(-±s)，%]

A：北京市；B：四川??；C遼寧??；D甘肅?。籈：吉林省圖1 四省一市精子濃度外部質(zhì)量控制Youden圖

參 數(shù)北京市(n=32)四川省(n=8)遼寧省(n=18)甘肅省(n=8)吉林省(n=10)樣本A樣本B樣本A樣本B樣本A樣本B樣本A樣本B樣本A樣本B均值(×106/ml)30±668±650±1138±668±670±754±639±651±643±9CV(%)19.698.7321.7814.638.369.9610.8816.3911.4620.26

2.Youden圖評估各實(shí)驗(yàn)室精子活動力結(jié)果：分別計(jì)算樣本A和B的95%CI，并將每個地區(qū)的質(zhì)控結(jié)果制作Youden圖(圖2)。五家單位分別有9.38%(3/32)、25.00%(2/8)、44.44%(8/18)、12.50%(1/8)和30.00%(3/10)的兩個質(zhì)控品均在中間的靶窗口中，即均在95%CI內(nèi)；而50.00%(16/32)、62.50%(5/8)、38.89%(7/18)、25.00%(4/8)和40.00%(4/10)其中一個樣本結(jié)果在95%CI內(nèi)，另一個樣本結(jié)果不在；其余的兩次結(jié)果均不在95%CI內(nèi)。

三、精子存活率外部質(zhì)量評估

1.精子存活率評估結(jié)果：四省一市的精子存活率的CV均在15%以下。其中遼寧省、甘肅省和吉林省的存活率均在10%以下；四川省樣本B的CV最大，為13.89%(表3)。

A：北京市；B：四川??；C遼寧?。籇甘肅??；E：吉林省圖2 四省一市精子活動力外部質(zhì)量控制Youden圖

參 數(shù)北京市(n=48)四川省(n=8)遼寧省(n=19)甘肅省(n=10)吉林省(n=10)樣本A樣本B樣本A樣本B樣本A樣本B樣本A樣本B樣本A樣本B均值(×106/ml)68±565±767±266±964±668±685±470±465±268±6CV(%)7.9610.762.5813.899.189.134.496.503.199.89

2.Youden圖評估各實(shí)驗(yàn)室精子存活率結(jié)果：分別計(jì)算樣本A和B的95%CI，并將每個地區(qū)的質(zhì)控結(jié)果制作Youden圖(圖3)。五家單位分別有8.33%(4/48)、37.50%(3/8)、47.37%(9/19)、10.00%(1/10)和20.00%(2/10)的兩個質(zhì)控品均在中間的靶窗口中，即均在95%CI內(nèi)；而45.83%(22/48)、50.00%(4/8)、36.84%(7/19)、70.00%(7/10)和60.00%(6/10)其中一個質(zhì)控品的結(jié)果在95%CI內(nèi)，另一個結(jié)果不在；其余兩次結(jié)果均不在95%CI內(nèi)。

四、正常形態(tài)精子百分率的評估結(jié)果

四省一市精子正常形態(tài)百分率的CV均在20%以上；其中吉林省的CV最高，為63.06%(表4)，提示精子形態(tài)較難質(zhì)控。

A：北京市；B：四川?。籆遼寧?。籇甘肅??；E：吉林省圖3 四省一市精子活動力外部質(zhì)量控制Youden圖

參 數(shù)北京市(n=48)四川省(n=10)遼寧省(n=18)甘肅省(n=10)吉林省(n=9)均值(×106/ml)33±1115±913±316±614±9CV(%)34.7159.7721.5839.4563.06

討 論

本研究采用WHO-5手冊標(biāo)準(zhǔn)化方法，首次在全國四省一市進(jìn)行精液分析，包括精子濃度、活動力、存活率及正常形態(tài)百分率評估的外部質(zhì)控。首次嘗試在精子形態(tài)學(xué)評估時嘗試多人共攬顯微鏡的方式進(jìn)行外部質(zhì)控，結(jié)果顯示了該方式的優(yōu)越性。

Gandini等[8]在對7個樣品進(jìn)行的精子濃度外部質(zhì)控中，CV介于29.67%和52.08%之間。Filimberti等[9]報(bào)告了15年的精子濃度分析的外部質(zhì)控中，有46.65%的受試者的CV占59.03%，最高達(dá)75.14%。而本研究中精子濃度評估的結(jié)果，只有吉林省兩個質(zhì)控樣本的CV在10%以下，其他的CV介于13.94%和54.26%之間。本研究中精子濃度評估的CV值優(yōu)于上述兩個實(shí)驗(yàn)室。而其中一個樣本的CV高可能與參加外部質(zhì)控的實(shí)驗(yàn)室數(shù)量多有關(guān)。精子濃度的CV比精子活動力和存活率的高，原因在于計(jì)數(shù)精子濃度的同時，精子在快速運(yùn)動，因此精子的濃度越高，活動力越好，計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度越低。而且，本研究所用的精子濃度質(zhì)控標(biāo)本由新鮮精液樣本混合制備而成，充分混勻，并檢查排除有精子聚集者。

有研究表明，精子前向運(yùn)動(PR)的百分率與妊娠率呈正相關(guān)[10-11]。PR精子評估的準(zhǔn)確性直接影響受精能力的預(yù)測。本研究中，PR精子的CV在8.36%和21.78%之間，其中有六個樣本的CV小于15%。Filimberti等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，三次實(shí)驗(yàn)中均觀察到PR精子的CV高達(dá)60%，而我們的結(jié)果最高CV達(dá)到21.78%，明顯優(yōu)于Filimberti等[9]的研究結(jié)果。我們在進(jìn)行PR精子的評估時，采用WHO-5推薦的制作視頻的方式。如果有條件的話，也可以采用多人共攬顯微鏡，在同一視野下同時評估同一個樣本的活動力，效果會更好。計(jì)算機(jī)輔助活動力分析，雖然WHO-5手冊中介紹的內(nèi)容不多，但其在評估精子活動力中有優(yōu)勢，可以獲得多種參數(shù)，如平均路徑速度(vap)、直線速度(vsl)、曲線速度(vcl)和頭部橫向位移振幅(alh)。這些參數(shù)的平均值或中間值，可以監(jiān)測某些治療或遺傳干擾所導(dǎo)致的精子活動力變化，甚至可分辨出超活化的精子[12]。但是也有研究表明，在進(jìn)行人工與計(jì)算機(jī)輔助精子分析(CASA)的精液分析質(zhì)控時，除了非前向運(yùn)動精子活動力之外的其他參數(shù)與人工分析的質(zhì)量控制還是有顯著差異的[13]。

2003年Bj?rndahl等[14]對1 235份精液樣本進(jìn)行伊紅苯胺黑染色法首次評估了精子活動力，得到了與在相差顯微鏡下評估的同等效果。而WHO-5手冊中使用伊紅苯胺黑評估精子的存活率。伊紅苯胺黑法可以增加精子與背景的對比度，而且被染的精子不隨時間延長變化而加深，封片之后可以長期保存。本研究中精子存活率外部質(zhì)控結(jié)果的CV均在15%以下，在精液分析的幾個項(xiàng)目中是最優(yōu)的，提示其是最容易質(zhì)控的項(xiàng)目之一。

正常形態(tài)精子百分率與精子功能異常、體外受精率及宮腔內(nèi)人工授精(IUI)和常規(guī)IVF的成功率相關(guān)[15]。對男性生育潛力具有很高的預(yù)測價值，對于選擇輔助生殖技術(shù)治療方法至關(guān)重要[16-17]。精子形態(tài)學(xué)評估主觀性強(qiáng)，是最難分析的指標(biāo)之一[18]，與實(shí)驗(yàn)人員的理論標(biāo)準(zhǔn)掌握情況及評估的熟練程度密切相關(guān)。Filimberti等[9]的研究中正常形態(tài)率結(jié)果的CV在15%～90%之間，而且高CV值與染色方法和染色程序無關(guān)，他采用的三種染色方法的CV都非常高，在88.6%～105.6%之間。Punjabi等[18]的研究中，巴氏染色后的CV在44%～65%之間。他們的研究表明，這種高的CV系數(shù)可以通過不斷的培訓(xùn)、教學(xué)和訓(xùn)練而逐漸改善。

本研究中，精子形態(tài)學(xué)分析的CV介于21.58%～63.06%之間，優(yōu)于之前的研究結(jié)果。WHO-5手冊培訓(xùn)之后，使用多人共攬顯微鏡的方式，得到了比用形態(tài)照片和單個顯微鏡評估更好的結(jié)果。精子形態(tài)學(xué)評估的主觀性較強(qiáng)，評估標(biāo)準(zhǔn)的難掌握，不易穩(wěn)定。再加上WHO-5手冊的正常參考值下限為4%，使得臨床上對精子形態(tài)學(xué)評估報(bào)告的可信度降低[15]。而且根據(jù)本研究小組在之前的調(diào)查中顯示，目前精子形態(tài)學(xué)評估的染色方法超過5種，在臨床中最常用的方法是Diff-Quik方法，這種方法可以快速染色和出報(bào)告，但缺點(diǎn)是對精子缺陷的細(xì)節(jié)染色較差；如果形態(tài)學(xué)評估的技術(shù)人員不固定，對于一些已經(jīng)掌握了某種染色和評估方法的技術(shù)人員培訓(xùn)的效果不佳；實(shí)施形態(tài)學(xué)評估內(nèi)部質(zhì)量控制的實(shí)驗(yàn)室很少，這與法國一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的調(diào)查結(jié)果一致[19]。

Youden圖顯示兩個樣本的結(jié)果均在中間的靶窗口中，說明兩個樣本均在95%CI內(nèi)；而如果其中一個樣本結(jié)果在95%CI內(nèi)，另一個樣本結(jié)果不在95%CI內(nèi)，提示可能由于實(shí)驗(yàn)過程中的隨機(jī)誤差而造成結(jié)果差異；兩個樣本的結(jié)果均高出或均低于95%CI，提示可能由于系統(tǒng)誤差造成的結(jié)果差異。Youden圖顯示，遼寧省的精子濃度、活動力和存活率的結(jié)果中，兩個結(jié)果均在95%CI的概率高于其他地區(qū)。精子濃度中五個省市的大部分實(shí)驗(yàn)室中一個樣本在控。采用進(jìn)口牛鮑式計(jì)數(shù)板的精子濃度質(zhì)控方法優(yōu)于其他方法。

本研究在全國四省一直轄市，進(jìn)行了精液分析外部質(zhì)量控制方法，是可行的，其結(jié)果是可靠的。本研究依賴于WHO-5手冊精液分析標(biāo)準(zhǔn)化操作培訓(xùn)班，初步在全國范圍內(nèi)建立精液分析外部質(zhì)量控制網(wǎng)絡(luò)的方法，但精液分析外部質(zhì)量控制網(wǎng)絡(luò)的建立尚處于起步和探索階段，急需進(jìn)一步提高。精液分析外部質(zhì)量控制需要長期堅(jiān)持，任重而道遠(yuǎn)。我們期望，在WHO-5手冊的標(biāo)準(zhǔn)化操作方法基礎(chǔ)上；在本研究團(tuán)隊(duì)長期以來的精液分析標(biāo)準(zhǔn)化理論與操作培訓(xùn)的基礎(chǔ)上；也需要從事精液分析的技術(shù)人員的共同努力，必然將在全國范圍內(nèi)建立精液分析外部質(zhì)量控制網(wǎng)絡(luò)。本研究團(tuán)隊(duì)會在實(shí)踐中不斷探索適合當(dāng)前實(shí)際情況的外部質(zhì)量控制的方法。以期逐步推動和實(shí)現(xiàn)全國精液分析外部質(zhì)控網(wǎng)絡(luò)的建立。