徐士儒，許健，陳聰，陳婉如，武婭婭，曾勇，李玉葉*

(1. 深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳 518043；2. 深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳 518043)

控制性超促排卵(COH)可以成功獲得多個成熟卵子，其應用于輔助生殖技術后，大大提高了體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的妊娠成功率。隨著COH藥物及方案的發(fā)展，如何選擇合適的COH方案，成為臨床醫(yī)生關注的焦點。IVF的成功取決于夫婦雙方的自身條件和IVF臨床實施過程的調控，在胚胎實驗室技術和環(huán)境穩(wěn)定的前提下，臨床促排卵方案的選擇對臨床結局的影響至關重要。目前，常用方案主要包括促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)長方案和近年來新興的GnRH拮抗劑(GnRH-ant)方案。

GnRH-ant是下丘腦分泌產(chǎn)生的肽類激素，其主要的生理作用是促進性腺激素的釋放，即黃體生成激素(LH)和卵泡刺激素(FSH)。GnRH-ant可通過與垂體GnRH受體結合，阻斷內(nèi)源性GnRH的作用，以抑制促性腺激素的釋放，進而抑制內(nèi)源性LH釋放，減少FSH的產(chǎn)生。國內(nèi)外大量臨床研究已證實GnRH-ant方案有效、簡便、靈活、安全，且作用更加迅速[1]，因此GnRH-ant在輔助生殖領域得到了廣泛的應用。也有越來越多的研究表明，與傳統(tǒng)GnRH-a長方案相比，GnRH-ant方案可獲得相似的臨床妊娠率及活產(chǎn)率[2-3]。然而研究發(fā)現(xiàn)與GnRH-a相比，GnRH-ant方案的新鮮周期移植妊娠率比較低，但是采用凍融胚胎移植(FET)時兩者的妊娠率并無顯著性差異，提示GnRH-ant對內(nèi)膜可能存在不良影響[4]。文獻報道GnRH-ant組子宮內(nèi)膜容受性標志性分子同源框基因10(HOXA10)的表達顯著下降[5-6]，然而有研究發(fā)現(xiàn)與自然周期相比較，GnRH-ant方案對子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學的影響并無明顯差異[7]。因此，GnRH-ant方案對子宮內(nèi)膜容受性的影響仍存在爭議。

在胚胎種植過程中，子宮內(nèi)膜募集大量的免疫細胞并表達多種細胞因子及關鍵分子，參與滋養(yǎng)層侵襲、血管新生、蛻膜化及母胎免疫耐受等關鍵事件，在胚胎著床及胎兒正常生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。在種植窗期，若子宮內(nèi)膜免疫細胞數(shù)量發(fā)生異常，將導致不良妊娠結局的發(fā)生。目前GnRH-ant方案是否對子宮內(nèi)膜免疫細胞數(shù)量產(chǎn)生影響尚未見相關報道。因此本研究收集了育齡婦女自然周期黃體中期、GnRH-ant與GnRH-a方案取卵后黃體中期的子宮內(nèi)膜樣本，探討GnRH-ant方案對子宮內(nèi)膜免疫細胞數(shù)量的影響。

資料與方法

一、研究對象

收集2017年5～11月在深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行IVF-ET治療的女性為研究對象，納入標準：(1)年齡20～40歲；(2)B超及子宮輸卵管造影排除子宮畸形；(3)近3個月無激素類藥物使用史；(4)月經(jīng)周期規(guī)律，周期28～32 d；(5)排卵日子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm；(6)自然周期B超監(jiān)測正常排卵的患者或COH周期中獲卵數(shù)≥20個為預防卵巢過度刺激綜合征(OHSS)而取消新鮮胚胎移植的患者；(7)FSH<10 U/L，抗苗勒管激素(AMH)>3.0 ng/ml。

嚴格按照納入標準，共納入34例研究對象，按照促排卵方案不同分為3組：自然周期組19例，GnRH-ant組7例，GnRH-a組8例。本研究獲得深圳中山泌尿外科醫(yī)院倫理委員會批準，所有樣本的采集均簽署知情同意書。

二、促排卵方案

1.GnRH-ant方案：患者月經(jīng)周期第2～3天抽血查基礎性激素水平，同時B超監(jiān)測卵泡狀態(tài)，當E2<293.6 pmol/L、FSH<10 U/L且B超最大卵泡直徑<8 mm時，開始促排卵。使用重組人促卵泡素(默克，德國)及注射用尿促性素(珠海麗珠)112.5～225 U/d進行COH，定期監(jiān)測卵泡生長及血清E2水平，當主導卵泡直徑達到11～12 mm時，加用GnRH-ant(酸醋加尼瑞克，默克，德國)0.25 mg/d直至HCG扳機日，當有3個主導卵泡直徑≥17 mm或2個優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm時，注射HCG(珠海麗珠)5 000～10 000 U，36 h后在陰道B超引導下實施采卵術。

2.GnRH-a方案：患者于前一周期黃體中期開始皮下注射醋酸曲普瑞林(達必佳，輝凌，德國)0.1 mg/d，降調16 d后，抽血查基礎性激素水平及B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，當垂體抑制達到相應標準(E2<183.5 pmol/L，無卵巢囊腫，最大竇卵泡直徑<8 mm)時，開始使用重組人促卵泡素及尿促性素112.5～225 U/d進行COH，定期監(jiān)測卵泡生長及血清E2水平，當有3個主導卵泡直徑≥17 mm或2個優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm時，注射HCG 5 000～10 000 U，36 h后在陰道B超引導下實施采卵術。

3. 自然周期方案：自月經(jīng)周期第10天起，B超結合尿LH監(jiān)測排卵。

三、內(nèi)膜標本收集

1.自然周期黃體中期取內(nèi)膜：自月經(jīng)周期第10天起，B超結合尿LH監(jiān)測排卵，排卵后第7～8天，利用子宮內(nèi)膜取樣器(Gynetics，Belgium，比利時)刮取少量子宮腔內(nèi)膜組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗去除組織表面血污，于10%中性福爾馬林固定液中固定4～6 h。組織常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟及包埋。

2.GnRH-ant方案和GnRH-a方案取內(nèi)膜：GnRH-ant方案和GnRH-a方案取卵后取消或自動放棄新鮮胚胎移植患者，取卵后第2天開始黃體酮(安琪坦，博賞，法國)600 mg/d黃體支持，7 d后行內(nèi)膜抽吸，內(nèi)膜標本處理同自然周期。

四、子宮內(nèi)膜形態(tài)學分期

常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，根據(jù)Noyes標準[8]，在光鏡顯微鏡下確定子宮內(nèi)膜分期。

五、免疫組化檢測方法及結果判定

石蠟包埋的子宮內(nèi)膜組織作4 μm厚度切片，運用自動免疫組化儀(Leica，Bond Ⅲ，美國)進行免疫組化實驗。免疫組化使用的一抗信息：CD56(上海基因科技)，CD68(Novocastra，美國)，CD163(上?；蚩萍?，CD1a(Novocastra，美國)，CD8(Novocastra，美國)，F(xiàn)oxp3(eBioscience，美國)。

為準確定量分析子宮內(nèi)膜各免疫細胞的含量，我中心引進Vectra自動病理成像定量分析系統(tǒng)(Perkin Elmer，美國)。首先在低倍鏡下掃描整張切片，然后在高倍鏡視野下(放大率×200)，每張切片隨機采集30張圖像。使用InForm多光譜圖像分析軟件進行圖像的光譜分析，準確探測和測量弱信號以及重疊的信號。根據(jù)不同的著色，在病理技術人員的監(jiān)督下對每張玻片的每種染色進行不同光譜的拆分，訓導軟件自動識別視野下的組織區(qū)域、空白區(qū)域以及分布在組織區(qū)域的陽性免疫細胞和所有子宮內(nèi)膜細胞，操作流程按參考文獻所述。最后，納入被組織覆蓋面積超過80%的圖像，陽性細胞率定義為陽性免疫細胞數(shù)/子宮內(nèi)膜總細胞數(shù)×100%，最終計算30張圖像的平均值為該免疫細胞的陽性細胞率。

六、性激素水平測定

采用羅氏電化學發(fā)光儀(Cobas e601，羅氏，瑞士)檢測血清E2、孕酮(P)水平，所用配套試劑盒均購于瑞士羅氏公司。

七、統(tǒng)計學分析

結 果

一、患者一般資料

本項研究共納入34例研究對象，其中自然周期組19例，GnRH-ant組7例，GnRH-a組8例。3組患者間年齡、體重指數(shù)(BMI)以及取子宮內(nèi)膜當天子宮內(nèi)膜厚度比較均無顯著性差異(P>0.05)；GnRH-ant組與GnRH-a組的獲卵數(shù)及HCG日E2水平比較均無顯著性差異(P均>0.05)；而GnRH-ant組的HCG日P水平顯著高于GnRH-a組(P<0.05)(表1)。

表1 三組患者基本資料比較(-±s)

二、子宮內(nèi)膜組織學分期

根據(jù)“NOYES(1950)時序”子宮內(nèi)膜形態(tài)學分期標準[8]，對不同促排方案收集的子宮內(nèi)膜進行組織形態(tài)學比較。本研究納入的3組患者的分期情況分別是：自然周期組患者(中期19例)，GnRH-ant組患者(中期7例)，GnRH-a組患者(中期7例、晚期1例)。結果顯示，與自然周期相比，GnRH-ant與GnRH-a組患者的子宮內(nèi)膜分期并無顯著性差異(P>0.05)，大部分處于中期。

三、子宮內(nèi)膜免疫細胞數(shù)量的變化

運用免疫組化及自動化數(shù)字分析體系對黃體中期子宮內(nèi)膜各免疫細胞進行定量分析，比較GnRH-ant組、GnRH-a組及自然周期組子宮內(nèi)膜各免疫細胞數(shù)量變化情況。與自然周期組比較，GnRH-ant組子宮內(nèi)膜CD56+NK細胞、CD1a+樹突狀細胞及CD8+T細胞陽性細胞率顯著上升(P均<0.05)；GnRH-a組子宮內(nèi)膜CD56+NK細胞，CD68+巨噬細胞顯著增加(P均<0.05)；而GnRH-ant組與GnRH-a組之間比較，各免疫細胞的數(shù)量變化無顯著性差異(P均>0.05)(表2，圖1)。

表2 三種不同促排方案間子宮內(nèi)膜各免疫細胞陽性細胞率比較 (%)

A：CD56+細胞占子宮內(nèi)膜總細胞的百分比；B：Foxp3+細胞占子宮內(nèi)膜總細胞的百分比；C：CD163+細胞占子宮內(nèi)膜總細胞的百分比；D：CD68+細胞占子宮內(nèi)膜總細胞的百分比；E：CD1a+細胞占子宮內(nèi)膜總細胞的百分比；F：CD8+細胞占子宮內(nèi)膜總細胞的百分比。GnRH-ant組和GnRH-a組分別與自然周期組相比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖1 不同促排方案間子宮內(nèi)膜各免疫細胞陽性細胞率比較

討 論

GnRH-ant是一種垂體GnRH受體的競爭性阻斷劑，它作用快速、安全，且GnRH-ant最大的好處在于不會引起類似GnRH-a造成的卵巢抑制，減少了外源性促性腺激素的劑量，從而減輕患者的經(jīng)濟負擔。并且在COH過程中，選擇GnRH-ant方案，結合GnRH-a替代HCG誘發(fā)卵子成熟，能夠降低OHSS的發(fā)生率[9]。由于具有上述優(yōu)勢，近年來，GnRH-ant被廣泛應用于輔助生殖技術中。

雖然有很多Meta分析比較GnRH-ant與GnRH-a方案對妊娠結局的影響，然而得出的結論不盡相同[2，10-11]。有研究認為尚不能將所有反應類型的患者合并分析GnRH-a和GnRH-ant對妊娠結局的影響。在不同反應類型患者之間，兩種方案對妊娠結局的影響可能存在差異。另有文獻報道，行GnRH-ant方案的患者，采用FET的妊娠率與GnRH-a方案無顯著性差異，而采用新鮮周期移植的妊娠率則明顯低于GnRH-a方案組，由此猜測GnRH-ant對內(nèi)膜容受性可能存在不良影響[4]。小鼠實驗證明，GnRH-ant通過改變HOXA10 DNA的甲基化，抑制HOXA10的表達，從而降低子宮內(nèi)膜容受性[5-6]。Ruan等[12]在小鼠實驗中，對種植窗期子宮內(nèi)膜容受性標記分子進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，與GnRH-a組相比，GnRH-ant組的胚胎種植率降低，同時內(nèi)膜容受性標志分子白血病抑制因子(LIF)和整合素β3的表達也相應減少。由此可見，GnRH-ant可能通過降低與胚胎種植相關的關鍵蛋白的表達，降低了子宮內(nèi)膜容受性。Macklon等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，與自然周期相比，GnRH-ant方案引起子宮內(nèi)膜多種基因表達出現(xiàn)顯著變化，這些基因主要與T細胞受體信號通路、細胞黏附及信號轉導相關。然而GnRH-ant與GnRH-a方案對子宮內(nèi)膜容受性影響的機制，至今仍未闡明。

胚胎的種植及早期生長發(fā)育是一個炎癥刺激過程，在這一過程中，母體子宮內(nèi)膜募集大量的免疫細胞以幫助胚胎成功種植與生長，同時也要防止母體對胚胎的免疫排斥。一旦免疫細胞的數(shù)量發(fā)生異常，則會導致妊娠失敗的發(fā)生[14-15]。本研究檢測了高反應人群使用GnRH-ant和GnRH-a方案對子宮內(nèi)膜各免疫細胞數(shù)量的影響，結果顯示與自然周期比較，GnRH-ant和GnRH-a方案均可顯著增加子宮內(nèi)膜NK細胞數(shù)量。有研究發(fā)現(xiàn)NK細胞在胚胎種植、滋養(yǎng)細胞侵襲、血管生成及妊娠維持過程中發(fā)揮關鍵作用[16-17]。反復種植失敗及復發(fā)性流產(chǎn)患者子宮內(nèi)膜NK細胞數(shù)量過高[18-19]。然而子宮內(nèi)膜NK細胞數(shù)量過高對妊娠結局的影響仍需要多中心的臨床研究進一步證實。本研究結果顯示，與自然周期比較，高反應人群GnRH-ant和GnRH-a方案子宮內(nèi)膜NK細胞的數(shù)量顯著升高。研究證實，促排過程中過高的雌孕激素可能影響子宮內(nèi)膜免疫細胞的募集[20]，因此我們猜測促排過程中過高的雌激素可能促進了子宮內(nèi)膜NK細胞數(shù)量的增加。而高反應人群使用GnRH-ant和GnRH-a方案后過高的NK細胞是否影響妊娠結局還需進一步探索。

同時，本研究進一步發(fā)現(xiàn)相較于自然周期組，GnRH-ant可上調子宮內(nèi)膜未成熟樹突狀細胞和CD8+T細胞的數(shù)量，而GnRH-a組無明顯改變。研究證實子宮內(nèi)膜或蛻膜樹突狀細胞參與胚胎植入、螺旋動脈重鑄和胎盤發(fā)育等諸多妊娠生理過程，它還可以通過作用于T細胞和NK細胞并調節(jié)其產(chǎn)生細胞因子，共同參與妊娠過程中的母胎對話。在早期妊娠建立的過程中，蛻膜樹突狀細胞直接參與了蛻膜化和胎盤的形成，條件性敲除蛻膜樹突狀細胞可導致嚴重的胚胎種植障礙，進而引起胚胎丟失[21]，而回輸樹突狀細胞可顯著降低孕鼠的胚胎吸收率[22]。同時，證據(jù)表明在母胎界面蛻膜CD8+T細胞能夠有效識別胎兒特異性抗原[23-24]。Blois等[25]在小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，敲除CD8+T細胞可破壞孕酮的保胎作用，進一步提示其在妊娠免疫耐受調節(jié)中發(fā)揮重要作用。由此我們猜測GnRH-ant方案顯著促進了子宮內(nèi)膜未成熟樹突狀細胞和CD8+T細胞數(shù)量的增加，這一現(xiàn)象可能破壞了子宮內(nèi)膜局部免疫微環(huán)境的穩(wěn)定，進而影響胚胎的種植。

綜上所述，GnRH-ant方案與GnRH-a方案相比，對子宮內(nèi)膜形態(tài)學分期無顯著影響，兩種方案對子宮內(nèi)膜各免疫細胞的影響也無顯著差異。但與自然周期相比，GnRH-ant方案與GnRH-a方案可顯著上調子宮內(nèi)膜不同免疫細胞的數(shù)量。由于本研究采集的樣本全部來自我中心且樣本量較少，因此仍需多中心大樣本量的前瞻性研究，對GnRH-ant具體是通過何種機制影響子宮內(nèi)膜各免疫細胞的數(shù)量以及是否影響妊娠結局進行深入探討。