張向?qū)?，孫歡，侯崇智，施偉棟，張書峰

膽道閉鎖(biliary atresia，BA)是一種只在新生兒期發(fā)生的特發(fā)性疾病，表現(xiàn)為膽道梗阻，是一種進(jìn)行性、特發(fā)性的肝外膽道炎癥性纖維化病變[1-3]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)肝門空腸吻合術(shù)(Kasai術(shù))后，BA患兒肝臟基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)水平顯著升高，不僅隨纖維化程度加重而升高，而且參與了BA引起的肝臟病理過程[4-5]；而轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)作為一種促纖維化因子，是導(dǎo)致肝纖維化的重要因子[6-7]；賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase-like protein，LOXL)作為一種依賴性胺類氧化酶，能夠增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力，其中LOXL-2與膽道上皮損傷有關(guān)[8]，在BA的病理過程中起著重要的作用[9]，因此，本研究通過建立BA幼鼠模型，研究幼鼠肝臟LOXL-2、MMP-7、MMP-9、TGF-β1的表達(dá)情況以及LOXL-2與MMP-7、MMP-9和TGF-β1的相關(guān)性，旨在探討LOXL-2與BA肝纖維化的關(guān)系以及在BA病理發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 膽道閉鎖幼鼠模型的建立

選擇體質(zhì)量20～30 g，8周齡Balb/c小鼠，以雄雌比2∶3比例進(jìn)行配對分籠。待孕鼠生下幼鼠后，將出生幼鼠(n=72)隨機(jī)平均分為對照組及模型組。對照組幼鼠腹腔注射病毒培養(yǎng)液，模型組小鼠于出生后24 h內(nèi)腹腔注射20 μL濃度為1×106Pfu/mL恒河猴輪狀病毒(Rhesus rotavirus，RRV，購自ATCC)。以幼鼠出現(xiàn)皮膚染黃、小便深黃及大便白色等表現(xiàn)認(rèn)為造模成功，母鼠拒絕哺乳的幼鼠及出生后72 h內(nèi)死亡幼鼠不計(jì)入統(tǒng)計(jì)，最終入組60只，對照組和模型組各30只。

1.2 標(biāo)本處理

幼鼠注射病毒后，于7 d、15 d及28 d分別取兩組幼鼠處死，取肝臟組織，部分放入無RNA酶滅菌EP管，置于液氮中保存，部分進(jìn)行石蠟包埋，免疫組化染色及切片。

1.3 qPCR檢測LOXL-2、MMP-7、MMP-9及TGF-β1 mRNA在肝臟中的水平

Trizol法提取肝臟總RNA，紫外分光光度計(jì)定量計(jì)算濃度，采用Applied biosystem逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA產(chǎn)物，以TaKaRa SYBR GreenⅠ染料試劑盒進(jìn)行qPCR定量分析，采用20 μL反應(yīng)體系，GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt計(jì)算樣本各基因相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1qPCR引物序列

1.4 Elisa檢測肝臟組織中LOXL-2、MMP-7、MMP-9及TGF-β1的表達(dá)

無菌操作稱取等量肝臟組織進(jìn)行勻漿，嚴(yán)格按照ELISA檢測kit(購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)操作說明進(jìn)行LOXL-2、MMP-7、MMP-9及TGF-β1蛋白水平測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LOXL-2在肝臟的表達(dá)情況

造模后7 d，模型組肝臟LOXL-2 mRNA、LOXL-2表達(dá)與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；造模后15 d、28 d表達(dá)均較7 d升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且分別高于同期對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2 肝臟MMP-7、MMP-9、TGF-β1的表達(dá)情況

與對照組比較，模型組幼鼠肝臟MMP-7 mRNA、MMP-7表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且28 d時(shí)，表達(dá)均較7 d顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。造模15d后，模型組肝臟MMP-9 mRNA、TGF-β1 mRNA、MMP-9、TGF-β1表達(dá)均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，造模28d，MMP-9 mRNA、MMP-9表達(dá)降低且與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而TGF-β1 mRNA、TGF-β1表達(dá)仍持續(xù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、表4。

2.3 相關(guān)性分析

模型組30例肝臟樣本中，LOXL-2的表達(dá)與MMP-7、TGF-β1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.707，P<0.001；r=0.556，P=0.001)，與MMP-9的表達(dá)無相關(guān)性(r=-0.022，P=0.907)。見圖1。

表2膽道閉鎖幼鼠肝臟組織中LOXL-2表達(dá)水平

注：*與同期對照組比較，P<0.05；#與同組7 d比較，P<0.05

表3各組肝臟組織中MMP-7 mRNA、MMP-9 mRNA、TGF-β1 mRNA表達(dá)

注：*與同期對照組比較，P<0.05；#與同組7 d比較，P<0.05

表4各組肝臟組織中MMP-7、MMP-9、TGF-β1的表達(dá)水平

注：*與同期對照組比較，P<0.05；#與同組7 d比較，P<0.05

3 討論

目前關(guān)于BA的病理學(xué)機(jī)制還未完全明確，一般認(rèn)為與病毒感染、先天膽管發(fā)育異常、基因等原因有關(guān)[10]。BA的臨床表現(xiàn)為持續(xù)黃疸、尿色加深、灰白色呈陶土樣大便等，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)肝衰竭表現(xiàn)，如腹水、食道胃底靜脈曲張、肝脾腫大等。當(dāng)BA并發(fā)肝臟損害時(shí)，其常見病因及病理學(xué)特征是病毒感染等造成肝臟損傷和膽管上皮細(xì)胞增生，以及由此導(dǎo)致的肝星形細(xì)胞激活，并且進(jìn)而造成細(xì)胞外基質(zhì)降解失衡，導(dǎo)致肝纖維化、甚至肝硬化[11]。而可導(dǎo)致肝纖維化的因子，最常見的有TGF-β1，由膽道上皮細(xì)胞生成，不僅是激活肝星形細(xì)胞的重要因子，而且是公認(rèn)的促纖維化因子[6]，本研究結(jié)果可見模型組幼鼠TGF-β1表達(dá)高于對照組，提示模型組可能存在由BA導(dǎo)致的肝星形細(xì)胞激活以及肝纖維化。

圖1LOXL-2與MMP-7、MMP-9、TGF-β1表達(dá)量的相關(guān)性

MMPs是肝內(nèi)參與細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)換并起到關(guān)鍵作用的因子，不僅參與了細(xì)胞外基質(zhì)的降解，而且在BA導(dǎo)致的肝纖維化過程中起到重要作用[4]。與肝纖維化密切相關(guān)的有MMP-1、MMP-2、MMP-9等[8,12]，其中，MMP-9可以參與降解正常肝竇基底膜及Ⅳ型膠原，影響并調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡，繼而調(diào)控肝纖維化[13]。本研究顯示，造模7 d、15 d，模型組幼鼠MMP-9表達(dá)水平均高于對照組，15 d時(shí)MMP-9 mRNA表達(dá)水平高于對照組，且其與MMP-9的表達(dá)水平均高于同組7 d時(shí)，說明MMP-9參與了BA導(dǎo)致的肝臟纖維化進(jìn)程。然而，28 d時(shí)，MMP-9和MMP-9 mRNA表達(dá)均降低且與7 d時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分析其原因，可能是因?yàn)镸MP-9對肝纖維化具有雙向調(diào)節(jié)作用。因?yàn)椋醒芯匡@示在肝纖維化的發(fā)展后期，機(jī)體常通過降解沉積過多的膠原和連接蛋白來反向阻止纖維化[14]，因此，也間接提示在本研究中，在造模28 d時(shí)，模型組小鼠可能已發(fā)生肝硬化以及由此導(dǎo)致的膠原和連接蛋白降解增加，并且MMP-9可能參與了上述過程。

在MMPs家族中，關(guān)于MMP-7與BA相互關(guān)系的研究相對較少，但已有研究發(fā)現(xiàn)MMP-7在BA中可以用于預(yù)測術(shù)后肝纖維化且具有較高的特異性[15]，MMP-7作為多條促纖維化通路過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白及產(chǎn)物[16]，被認(rèn)為是反映肝纖維化程度的有效指標(biāo)[17]。本研究結(jié)果顯示，MMP-7在BA模型組幼鼠肝臟表達(dá)顯著高于對照組，與余晨等的臨床研究結(jié)果一致[5]。同時(shí)隨著時(shí)間變化，造模28 d時(shí)MMP-7、MMP-7 mRNA表達(dá)高與7 d、15 d，分析其原因，可能與模型組小鼠肝纖維化程度有關(guān)。

LOXL是一類分泌性銅依賴性胺類氧化酶，LOXL-2可導(dǎo)致膽道上皮緊密連接的通透性增加[18]。膽管在膽汁合成、排泄的過程中發(fā)揮重要的作用，膽管的完整性是肝功能正常的一個(gè)前提條件，正常的膽管分泌功能依賴于正常的上皮屏障功能，膽管疾病通常與膽管細(xì)胞的緊密連接相關(guān)[19]，而已有研究發(fā)現(xiàn)LOXL-2與膽道上皮損傷有關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，15 d、28 d時(shí)，LOLX-2在模型組幼鼠肝臟組織中表達(dá)高于對照組；相關(guān)性分析可見LOXL-2與TGF-β1的表達(dá)情況呈正相關(guān)(r=0.556)，可能的原因是BA的病理生理過程中，LOXL-2、TGF-β1均有促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)的作用[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能上調(diào)LOXL-2表達(dá)，抑制TGF-β1信號通路后，LOXL-2轉(zhuǎn)錄及表達(dá)減少，提示TGF-β1可能參與LOXL-2轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的調(diào)控環(huán)節(jié)[21-25]；然而，阻斷LOXL-2表達(dá)后，又可逆轉(zhuǎn)TGF-β1信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[25-26]，但機(jī)制未明，因此，LOXL-2參與的信號通路及在EMT發(fā)生中的作用、TGF-β1對LOXL-2的具體調(diào)控機(jī)制以及相互之間的作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。另外，相關(guān)性分析還發(fā)現(xiàn)LOLX-2與MMP-7也具有相關(guān)性(r=0.707)，提示在BA所致肝纖維化的病理生理過程中，LOLX-2、TGF-β1、MMP-7可能通過某種作用機(jī)制協(xié)同促使BA并發(fā)肝纖維化的發(fā)生，但具體機(jī)制仍需研究。

綜上所述，本研究揭示了在BA中LOXL-2與MMP-7、MMP-9、TGF-β1的關(guān)系，但由于未對肝纖維化進(jìn)行病理分級，因此，尚不能說明LOXL-2與BA所致肝纖維化程度的關(guān)系，因此，LOXL-2參與BA所致肝纖維的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。