胡志良,阿里木江·阿不拉,王偉,肖永彪

直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，2015年我國結直腸癌發(fā)病例數(shù)達37.6萬例，死亡例數(shù)達19.1萬例，嚴重危害我國人民健康[1]。目前直腸癌的治療方式包括手術、放化療及靶向藥物治療等，但對于中晚期患者治療效果不理想，易復發(fā)轉移，預后較差[2]。由于直腸癌的病因及發(fā)病機制尚不明確，近年來對直腸癌發(fā)生發(fā)展分子機制的研究受到廣發(fā)關注。Twist基因位于7p21.1，編碼蛋白是具有特征性的螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)的Twist轉錄因子，其可形成同二聚體和異二聚體，與DNA 中E盒序列結合并調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程，如調(diào)節(jié)神經(jīng)管閉合、肢體發(fā)育和棕色脂肪代謝等[3]。研究表明，在肺癌、肝癌等多種腫瘤中Twist表達升高，其能促進下游基因如E-鈣黏素(E-cadherin)表達降低，導致腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉化(EMT)，腫瘤細胞浸潤、侵襲能力增強[4-5]。波形蛋白(Vimentin)位于10p13，該基因編碼Ⅲ型中間絲蛋白，與微管和肌動蛋白微絲一起構成細胞骨架，功能上負責維持細胞質(zhì)的細胞形狀和完整性，并穩(wěn)定細胞骨架相互作用，還作為參與細胞粘附、遷移及信號傳導等許多其他重要生物學過程。研究表明，腫瘤細胞中核因子-κB等信號通路的激活能夠促進Vimentin表達升高，導致腫瘤細胞易發(fā)生局部浸潤和遠處轉移[6]。此外，在非小細胞肺癌中Twist表達與Vimentin表達呈有關，兩者可能存在表達調(diào)控的關系，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。本研究通過檢測直腸癌組織中Twist及Vimentin表達，分析兩者之間的相關性，初步探討其作用機制及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月至2019年3月間在我院診治的80例直腸癌患者的臨床病理資料。其中男性43例，女性37例；年齡29～76歲，平均年齡(53.2±6.1)歲；伴遠隔器官轉移19例，無遠隔器官轉移61例；腫瘤直徑：<5 cm者55例，≥5 cm者25例；腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ～Ⅳ期22例；分化程度：高分化19例，中分化30例，低分化31例；浸潤深度：肌層23例，漿膜層57例；伴淋巴結轉移37例，無淋巴結轉移43例。納入標準[7]：①經(jīng)病理檢查明確診斷為直腸腺癌；②患者既往未接受過放化療、免疫治療等；③患者臨床病理資料和隨訪相關資料完整。排除標準：①合并有急慢性腸炎、炎癥性腸病等消化系統(tǒng)疾??；②合并急性泌尿系感染、結核菌感染等感染性疾?。虎酆喜⑵渌鞴俚膼盒阅[瘤。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準通過。

1.2 研究方法

應用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測癌組織和癌旁正常組織中Twist及Vimentin的表達。將術中新鮮留取(離體30 min以內(nèi))的組織置于EP管中，液氮凍存后置于-80 ℃冰箱保存。取約50 mg的組織標本，應用Trizol法提取組織中總RNA。以總RNA為模板，進行逆轉錄合成cDNA。反轉錄條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃5 min，反轉錄試劑盒購自Takara公司，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。Twist正向引物序列：5′-GTCCGCAGTCTTACGAGGAG-3′，反向引物序列：5′-GCTTGAGGGTCTGAATCTTGCT-3′；Vimentin正向引物:5′-GACGCCATCAACACCGAGTT-3′，反向引物序列:5′-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3′；內(nèi)參基因GAPDH的正向引物序列5′-CTGGGCTACACTGAG-CACC-3′，反向引物序列:5′-AAGTGGTCGTTGAGG-GCAATG-3′。qPCR反應體系20 μL，包括模板cDNA 2 μL，正向及反向引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL, 無RNA酶水6 μL。 Twist qPCR反應條件94 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環(huán)。Vimentin qPCR反應條件為：96 ℃ 10 min，96 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣本重復3次。Twist及Vimentin的相對表達量采用2-ΔCt法表示，目的基因Twist或Vimentin的表達水平相對于內(nèi)參基因GAPDH的比值為2-ΔCt，ΔCt=CtTwist/Vimentin-CtGAPDH。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 癌組織與癌旁組織中Twist、Vimentin表達比較

直腸癌組織中Twist的相對表達量為1.081±0.115，顯著高于癌旁組織的0.213±0.051(t=60.713，P=0.000)；直腸癌組織中Vimentin的相對表達量為2.138±0.216，顯著高于癌旁組織的1.037±0.134(t=38.741，P=0.000)；見圖1。

圖1直腸癌組織與癌旁組織Twist、Vimentin表達比較

2.2 癌組織中Twist、Vimentin表達與臨床病理特征間的關系

直腸癌組織中Twist、Vimentin的表達與腫瘤分期、淋巴結轉移有關，而與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤分化程度及漿膜浸潤無關，見表1。

2.3 直腸癌組織中Twist與Vimentin表達的相關性

Pearson線性相關分析結果表明，直腸癌癌組織中Twist的mRNA的相對表達量與Vimentin的mRNA的相對表達量呈明顯正相關(r=0.613，P=0.009)，見圖2。

表1直腸癌組織中Twist、Vimentin表達與患者臨床病理特征的關系

圖2直腸癌組織中Twist與Vimentin表達的相關性

3 討論

近年來隨著我國人民生活水平的提高，直腸癌的發(fā)病率逐漸升高，我國每年新發(fā)病例數(shù)約占全球發(fā)病例數(shù)的18%，嚴重威脅我國人民健康[8]。直腸癌的局部解剖結構復雜，手術難度較大，術后并發(fā)癥及復發(fā)率較高，特別是對于局部進展期及晚期患者，患者死亡率較高，預后較差[9]。因此需對直腸癌的發(fā)生和發(fā)展機制進行深入研究，尋找具有臨床意義的腫瘤標志物。上皮-間質(zhì)轉化(EMT)是使處于靜止穩(wěn)定狀態(tài)的上皮細胞能夠以單細胞的形式獲得遷移和侵入的能力的過程。大量研究表明，腫瘤細胞EMT重新激活，腫瘤細胞分子表型發(fā)生改變，上皮性表型特征的部分喪失，而部分獲得間充質(zhì)表型，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。

Twist又稱Twist家族bHLH轉錄因子1，含有特征性的bHLH結構域，能夠結合靶基因的DNA序列，發(fā)揮轉錄調(diào)控的作用。Twist能夠誘導腫瘤干細胞的形成促進腫瘤發(fā)生、促進原發(fā)性腫瘤生長及腫瘤轉移。研究表明，Twist在多種腫瘤中過表達，Twist的過度表達誘導EMT，促進腫瘤轉移形成，靶向藥物抑制Twist及下游相關分子能夠明顯抑制腫瘤生長、限制腫瘤轉移、逆轉耐藥性，從而提高癌癥患者的存活率[11]。本研究中，直腸癌組織中Twist的mRNA的相對表達量明顯高于癌旁正常組織，目前其具體調(diào)控機制尚不清楚，可能與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞、腫瘤細胞間釋放的TNF、TGF-β等細胞因子增多有關。研究表明，TNF、TGF-β等能結合于腫瘤細胞表面的相應受體，激活相應細胞信號傳導通路，如核因子κB通路等，促進Twist的表達[12]。本研究中直腸癌組織中Twist的表達與腫瘤分期及淋巴結轉移有關，表明Twist表達與直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關。一方面，Twist表達水平升高能夠直接結合并抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(ARF)的表達，從而抑制P53凋亡信號通路，導致腫瘤細胞過度增殖，凋亡減少，腫瘤分期升高[13]。另一方面，腫瘤細胞中Twist的表達升高后，通過調(diào)節(jié)鈣粘蛋白家族的表達，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如腫瘤細胞表面N-鈣黏素表達降低，導致細胞間粘附能力下降，促進腫瘤細胞的淋巴或血行轉移[14]。

Vimentin是中間絲蛋白家族的主要成分，在正常間充質(zhì)細胞中普遍表達，維持細胞完整性及抗應激性。Vimentin是EMT的重要標志物之一，在多種惡性腫瘤中過表達，包括前列腺癌、胃腸道腫瘤、乳腺癌及肺癌等[15]。腫瘤中Vimentin的過度表達與腫瘤增殖、侵襲和患者預后不良密切相關，因而有可能作為腫瘤診斷、治療的潛在靶標。本研究中，直腸癌組織中Vimentin的相對表達量顯著高于癌旁組織，其機制可能是轉錄后調(diào)控機制異常有關。研究表明，腫瘤發(fā)生時負性調(diào)控Vimentin表達的微小RNA -145表達下調(diào)，Vimentin的mRNA穩(wěn)定性增加，導致Vimentin的表達水平增加[16]。此外，本研究中，直腸癌組織中Vimentin的相對表達量與腫瘤分期、淋巴結轉移有關，較高腫瘤分期及伴淋巴結轉移的腫瘤組織中Vimentin表達明顯較高。Vimentin在正常生理條件下維持間充質(zhì)細胞的可塑性，而在腫瘤中具有促進腫瘤細胞遷移的作用，機制可能是Vimentin通過整合來自環(huán)境的機械輸入信號并調(diào)節(jié)微管和肌動球蛋白網(wǎng)絡的動力學來促進細胞遷移，促進癌細胞局部侵襲及淋巴結轉移[17-18]。本研究進一步研究直腸癌癌組織中Twist與Vimentin表達的相關性，結果兩者表達呈顯著正相關，表明兩者可能存在直接或間接的相互作用關系。研究表明，腫瘤細胞中轉化生長因子β信號通路激活后，促進Twist等轉錄因子的表達，Twist能夠直接結合Vimentin啟動子區(qū)，并促進間質(zhì)性表型Vimentin的表達，發(fā)揮促進腫瘤細胞惡性進展和轉移能力[19-20]。

綜上所述，直腸癌組織中Twist與Vimentin均表達升高，兩者表達呈明顯正相關，且均與腫瘤分期及淋巴結轉移有關，有可能成為新的直腸癌診斷、治療及預后評估的腫瘤標志物，但對于兩者之間具體相互作用及調(diào)控機制有待進一步研究。