何淑兵，左東明，張文山，劉博，智英輝，張國(guó)栓

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在我國(guó)各種惡性腫瘤中發(fā)病率居第二位[1]。全球每年新發(fā)胃癌病例100多萬，死亡約80多萬，其發(fā)病有明顯的地域差別，其中東南亞地區(qū)發(fā)病率最高，中國(guó)每年新發(fā)胃癌病例占全球的42%，死亡占35%[2]。因此，深入研究胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找診斷新的標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)，對(duì)防治胃癌提高人們的生活質(zhì)量具有重要價(jià)值。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，微小型RNA(microRNA,miRNA)是一種新的基因調(diào)控元件，其長(zhǎng)度約為22個(gè)堿基的單鏈RNA，不具有編碼蛋白的功能，可以使其靶基因降解或阻礙其靶基因的翻譯來調(diào)控其靶基因的表達(dá)[3]，從而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、干細(xì)胞分化、腫瘤血管生成、神經(jīng)元發(fā)育、腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等一系列生命活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)胃癌細(xì)胞及正常胃黏膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)并提取RNA進(jìn)行miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn),與正常胃黏膜細(xì)胞相比miR-648在胃癌細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)[4]，對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)RNA芯片測(cè)定的miRNA結(jié)果，證實(shí)miR-648在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中明顯上調(diào)[5]，但miR-648對(duì)胃癌細(xì)胞生物行為的影響及其具體分子機(jī)制目前還未見報(bào)道。因此，本課題就miR-648對(duì)胃癌細(xì)胞的生物學(xué)影響及其具體分子機(jī)制進(jìn)行研究，以期為胃癌的早期診斷和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌SGC-7901、MGC-803細(xì)胞系和正常胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物寶藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和DMEM試劑購(gòu)自Gibco；Trizol總RNA提取試劑購(gòu)于Invitrogen；RT Profiler PCR Array Kit購(gòu)于Qiagen；Fast Start Universal SYBR Green Master購(gòu)于Roche；胰蛋白酶購(gòu)于Sigma；抗β-actin 抗體購(gòu)于杭州聯(lián)科生物科技有限公司；Transwell小室購(gòu)于Millipore；CCK-8購(gòu)于Dojindo；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于南京凱基公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 real-time PCR法檢測(cè)RNA的表達(dá) 根據(jù)Trizol法提取總RNA,按照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行操作合成cDNA。MiR-648-F: 5′-GGAAGTGTGCAGGGC-3′, MiR-648-R-5′-AGTGCGTGTCGTGGAGTC-3′,脾酪氨酸激酶Syk-F:5′-TTTCGGACTTTCCAAAGCACTGCG-3′, Syk-R:5′-ACTCCAAAGCTCCAGACATCCTGT-3′。U6作為內(nèi)參，U6-F: 5 ′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 ′；U6-R:5′-CGCTT-CACGAATTTGCGTGTCAT-3′。根據(jù)SYBR Green I PCR 檢測(cè)試劑盒說明書在ABI7500熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火32 s,70 ℃延伸30 s,循環(huán)40次。溶解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s。2-ΔΔCt法測(cè)定各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。每個(gè)樣品孔重復(fù)檢測(cè)3次，取均值。

1.2.3 Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解提取各組總蛋白并用BCA法定量。取適量蛋白上樣后進(jìn)行SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)至PVDF膜后加入5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h,孵育相應(yīng)一抗，4 ℃條件下孵育過夜，洗膜室溫孵育相應(yīng)二抗2 h,洗膜后用化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)PVDF進(jìn)行曝光顯影，以(-actin為內(nèi)參，后采用成像掃描分析系統(tǒng)測(cè)定條帶的灰度值。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌SGC-7901細(xì)胞，適當(dāng)密度接種到6孔上，待細(xì)胞融合到70%時(shí)，按照LipofectmineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將干擾miR-648的模擬物anti-miR-648和其陰性對(duì)照anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞中，分別標(biāo)記為anti-miR-648組和anti-miR-NC組。轉(zhuǎn)染4 h后換為含血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將SGC-7901隨機(jī)分為miR-648組(轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-648模擬物)、miR-NC(轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR陰性對(duì)照)、anti-miR-648+si-Syk組(干擾miR-648表達(dá)的模擬物和沉默Syk的siRNA共轉(zhuǎn)染)、anti-miR-648+si-NC組(干擾miR-648表達(dá)的模擬物和沉默Syk的陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染)四組，采用上述方法轉(zhuǎn)染后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸液，按每孔2×103個(gè)接種到96孔板，待細(xì)胞貼壁后每孔加入CCK-8溶液15 μL,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱重培養(yǎng)2 h,用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm的吸光度。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組待測(cè)細(xì)胞，離心漂洗去上清，根據(jù)Annexin V-FITC 試劑盒處理細(xì)胞，簡(jiǎn)述步驟如下：緩沖液重懸細(xì)胞搖勻，避光孵育15 min后加入Annexin V-FITC, 再次避光孵育15 min后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.7 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)如下：Transwell小室在鋪板前30 min浸潤(rùn)在無血清培養(yǎng)基中，細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，每孔2×103個(gè)，小室內(nèi)無血清，培養(yǎng)板內(nèi)有血清，培養(yǎng)24 h后5%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗后結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗后用倒置顯微鏡拍照。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)前用20 mg/L Matrigel 1∶3稀釋包被Transwell小室底部膜上室面，4 ℃風(fēng)干后步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞中miR-648表達(dá)上調(diào)、Syk表達(dá)下調(diào)

圖1和表1顯示，與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞相比，胃癌SGC-7901、MGC-803細(xì)胞中miR-648的表達(dá)量明顯上調(diào)，Syk mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05)。

圖1Syk蛋白的表達(dá)

2.2 抑制miR-648表達(dá)抑制了胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡

圖2顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-648組細(xì)胞的凋亡率和Bax蛋白的表達(dá)量顯著上升，Bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。表2顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-648組胃癌SGC-7901細(xì)胞中miR-648的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，可見，成功轉(zhuǎn)染了抑制miR-648表達(dá)的胃癌SGC-7901細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，anti-miR-648組與anti-miR-NC組的細(xì)胞活性無顯著差異，轉(zhuǎn)染48 h和72 h后， anti-miR-648組細(xì)胞活性較anti-miR-NC組顯著下降；anti-miR-648組較anti-miR-NC組Cyclin D1的表達(dá)量明顯下降,P21蛋白的表達(dá)量明顯上升(P<0.05)。

表1miR-648和Syk在 SGC-7901、MGC-803細(xì)胞和GES-1細(xì)胞中的表達(dá)

注：與GES-1組比較，*P<0.05

2.3 抑制miR-648表達(dá)抑制了胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲

圖3和表3顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-648組細(xì)胞遷移和侵襲的數(shù)目顯著下降，E-cadherin蛋白的表達(dá)量顯著升高，MMP-2蛋白的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)?？梢?，抑制miR-648的表達(dá)對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的遷移和侵襲具有抑制作用。

圖2抑制miR-648對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡及增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表2抑制miR-648對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、凋亡的影響

圖3抑制miR-648對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4 miR-648可靶向抑制Syk的表達(dá)

圖4A為TargetScan(http://www.targetscan.org/)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果示意圖，表明miR-648與Syk存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。表 4為雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果，同miR-NC與WT-Syk共轉(zhuǎn)染相比，miR-648與WT-Syk共轉(zhuǎn)染后，SGC-7901細(xì)胞的熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)；但miR-NC、miR-648分別與MUT-Syk共轉(zhuǎn)染后，SGC-7901細(xì)胞的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，可見miR-648對(duì)Syk具有靶向作用。表5顯示，與miR-NC組相比，miR-648組中Syk mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；相反，anti-miR-648組中Syk mRNA和蛋白的表達(dá)量較anti-miR-NC組顯著升高(P<0.05)，可見miR-648可負(fù)向調(diào)控Syk的表達(dá)。

表3抑制miR-648對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲的影響

圖4Syk的3′UTR中含有miR-648的互補(bǔ)核苷酸鏈

2.5 沉默Syk可逆轉(zhuǎn)抑制miR-648對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

圖5和表6-7顯示，與 anti-miR-NC組相比，anti-miR-648組中Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白的表達(dá)量明顯下降,Syk、P21、Bax、E-cadherin蛋白的表達(dá)量明顯上升；轉(zhuǎn)染24 h后，anti-miR-648組與anti-miR-NC組的細(xì)胞活性無顯著差異，轉(zhuǎn)染48 h和72 h后， anti-miR-648組細(xì)胞活性較anti-miR-NC組顯著下降；anti-miR-648組較anti-miR-NC組細(xì)胞的凋亡率明顯上升，細(xì)胞和侵襲數(shù)目明顯下降(P<0.05)。與anti-miR-648+si-NC組相比，anti-miR-648+si-Syk組中Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白的表達(dá)量明顯上升,Syk、P21、Bax、E-cadherin蛋白的表達(dá)量明顯下降；轉(zhuǎn)染24 h后，anti-miR-648組與anti-miR-NC組的細(xì)胞活性無顯著差異，轉(zhuǎn)染48 h和72 h后， anti-miR-648組細(xì)胞活性較anti-miR-NC組顯著上升；anti-miR-648組較anti-miR-NC組細(xì)胞的凋亡率明顯下降，細(xì)胞和侵襲數(shù)目明顯上升(P<0.05)。綜上所述，抑制Syk表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)抑制miR-648對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。

表4雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5miR-648調(diào)控Syk的表達(dá)

注：與miR-NC組比較，aP<0.05；與anti-miR-NC組比較，bP<0.05

圖5Syk及增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白的表達(dá)

表6抑制Syk表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)抑制miR-648對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、凋亡的影響

注：與anti-miR-NC組比較，aP<0.05；與anti-miR-648+si-NC組比較，bP<0.05

表7抑制Syk表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)抑制miR-648對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲的影響

注：與anti-miR-NC組比較，aP<0.05；與anti-miR-648+si-NC組比較，bP<0.05

3 討論

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其有高發(fā)病率、高死亡率、預(yù)后差的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅到人類健康[6]。目前手術(shù)根治是胃癌的主要治療方法，早期患者術(shù)后5年生存率可達(dá)90%多，但因胃癌早期癥狀不明顯及常規(guī)胃鏡檢查普及不足等原因，很大一部分患者在確診時(shí)就已經(jīng)處于胃癌進(jìn)展期，錯(cuò)過了最佳手術(shù)治療時(shí)間，5年生存率僅為20%左右[7]?，F(xiàn)有胃癌治療手段有限，單純手術(shù)治療的總生存率較低，放療和化療未能產(chǎn)生顯著效果多用于術(shù)前術(shù)后輔助治療，我國(guó)每年因胃癌去世的患者近352 300人[8]。因此，急需尋找到一種療效好、不良反應(yīng)小的新型治療方法應(yīng)對(duì)胃癌發(fā)病率和死亡率日益增長(zhǎng)的現(xiàn)狀。

大量研究表明，微小型RNA(microRNA，miRNA)是腫瘤發(fā)生發(fā)展中重要的參與者，已成為腫瘤研究中的熱點(diǎn)。miRNA通過與靶基因的3′UTR完全互補(bǔ)切割靶基因的mRNA或不完全互補(bǔ)抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控一系列重要生命過程[9]，包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等[10]，在多種腫瘤中發(fā)揮作用，如張等人發(fā)現(xiàn)miR-648在前列腺癌中上調(diào)表達(dá)，并鑒定miR-648為新的候選前列腺癌miRNA生物標(biāo)志物[11]，Simone kreth 等人鑒定miR-648為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中MGMT的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子[12]。據(jù)研究報(bào)道，miR-648在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[4-5]，但其對(duì)胃癌細(xì)胞的具體生物學(xué)影響還未見報(bào)道。本課題通過RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜上皮細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞中miR-648的表達(dá)顯著上調(diào)，與此前研究結(jié)論[4-5]一致，提示其可能起到促癌基因的作用。抑制miR-648的表達(dá)則細(xì)胞活性及遷移、侵襲數(shù)目顯著下降，凋亡率顯著升高，且Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白的表達(dá)量明顯下降，P21、Bax、E-cadherin蛋白的表達(dá)量顯著上升。結(jié)果證明抑制miR-648的表達(dá)抑制胃癌的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)其細(xì)胞的凋亡，但其具體分子機(jī)制尚不清楚。

本課題通過生物信息預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Syk可能是miR-648的靶基因， miR-648與Syk的3′UTR之間存在互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸位點(diǎn)。脾酪氨酸激酶(Spleen Tyrosine Kinase,Syk)是非受體型蛋白酪氨酸激酶，在造血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛存在，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用[13]。近年研究表明，Syk的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可以抑制多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)[14-16]，如Syk可抑制乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[17]，抑制大腸癌大腸癌的浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分化等[18]。 研究發(fā)現(xiàn)Syk在胃癌組織中下調(diào)表達(dá)，Syk的表達(dá)缺失與胃癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)聯(lián)性[19-20]，并有研究證明Syk對(duì)胃癌的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移有抑制作用，Syk可誘導(dǎo)胃癌組織中腫瘤細(xì)胞的凋亡[21]。熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-648可靶向調(diào)控Syk的表達(dá)，提示SKY是miR-648的下游靶基因。此外，研究還發(fā)現(xiàn)沉默Syk可逆轉(zhuǎn)抑制miR-424對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，間接證實(shí)兩者之間存在調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，本課題明確了miR-648對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，并初步探討了miR-648可通過負(fù)調(diào)控Syk發(fā)揮抗腫瘤的作用機(jī)制，為胃癌的早期診斷和臨床治療提供了可靠的理論依據(jù)和新的治療思路。