楊志杰 樊星花 梁宇紅

（廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院暨柳州市工人醫(yī)院藥學(xué)部 廣西 柳州 545005）

落地生根Bryophyllum pinnatum (L.f.) Oken為景天科(Crassulaceae)落地生根屬(BryophllurnSalisb)植物，在廣西、廣東、云南、福建和臺(tái)灣等地區(qū)廣泛分布，別名為花蝴蝶、倒吊蓮、土三七、葉生根、番鬼牡丹、葉爆芽、天燈籠、槍刀草、厚面皮、著生藥等，全草入藥，性酸、寒[1]。除具有觀賞價(jià)值外，還具有藥用價(jià)值，可治創(chuàng)傷出血、疔瘡、乳腺炎、跌打損傷吐血、熱性胃痛、關(guān)節(jié)腫痛、急性中耳炎、皮膚潰瘍等[2]。在國(guó)外，落地生根廣泛分布于非洲、美洲熱帶以及印度和澳大利亞，作為傳統(tǒng)藥物用于腹瀉、嘔吐、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病原微生物、利什曼病及抗變態(tài)反應(yīng)等[3]。本實(shí)驗(yàn)就落地生根對(duì)H22肝癌小鼠免疫功能影響做研究，嘗試對(duì)落地生根水提物抗腫瘤的作用進(jìn)行初步探討。

1.資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 細(xì)胞株及動(dòng)物 小鼠H22肝癌細(xì)胞由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室提供，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。昆明種小鼠60只，體質(zhì)量18～22g，雌雄不拘，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證 SCXK2009-0002。

1.1.2 藥品與試劑 落地生根采取于廣西來(lái)賓市忻城縣，經(jīng)河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院鄧晰朝副教授鑒定為鑒定景天科(Crassulaceae)落地生根屬(BryophllurnSalisb)植物落地生根Bryophyllum pinnatum (L.f.) Oken。氟尿嘧啶注射液（5-FU），天津金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)1504261。一得閣墨汁購(gòu)于一得閣墨業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器

多功能提取濃縮機(jī)組(上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；分析天平(日本島津公司)；DRAGON LAB移液器(20～200μL)( 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司)；酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂(lè)BIORAD公司）。

1.3 藥材提取

取6100g落地生根干藥材，加10倍量蒸餾水，回流提取3次，每次1小時(shí)，過(guò)濾，合并3次濾液，濃縮成浸膏，浸膏量為1246.8g，置于4℃冰箱，待用。

1.4 造模、分組及給藥

取凍存的H22肝癌細(xì)胞，復(fù)蘇為0.9%氯NaCL溶液混懸，小鼠腹腔注射，連續(xù)傳兩代。無(wú)菌條件下取H22肝癌小鼠腹水，稀釋成含量為1×107·mL-1的細(xì)胞懸液后于小鼠右側(cè)腋窩皮下接種，小鼠接種腫瘤細(xì)胞懸液后稱(chēng)體重，隨機(jī)分為空白組、陽(yáng)性組（5-FU）、模型組、水提物低劑量組（4g·kg-1生藥量）、中劑量組（8g·kg-1生藥量）及高劑量組（16g·kg-1生藥量）共6組，每組10只?？瞻捉M為正常小組，陽(yáng)性組按20mg·kg-1給予5-FU腹腔注射，模型組、空白組灌服等體積生理鹽水。各組均于接種后24小時(shí)開(kāi)始給藥，每天1次，連續(xù)15天。

1.5 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

末次給藥24小時(shí)后,尾靜脈注射以生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁,每10g體質(zhì)量注射0.1mL，墨汁注入后立即計(jì)時(shí)，于注入墨汁后第2（t1）、10min（t2），分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μL，加入到2mL 0.1% Na2CO3溶液中，搖勻。以0.1% Na2CO3溶液作空白對(duì)照，用酶標(biāo)儀在600nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定光密度值（OD）。將小鼠處死，取肝、脾，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算吞噬指數(shù)（a)。吞噬指數(shù)計(jì)算方法：K=（lgOD1-lgOD2)/(t2-t1).吞噬指數(shù)（a)=體質(zhì)量×K1/3（肝質(zhì)量+脾質(zhì)量）。

1.6 瘤重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)的測(cè)定

分別稱(chēng)取小鼠體重，脫頸椎處死小鼠，剝離腫瘤組織，取小鼠脾臟、胸腺和肝臟，精密稱(chēng)定，計(jì)算抑瘤率、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和肝臟指數(shù)：腫瘤抑制率（%）={1-（平均實(shí)驗(yàn)組瘤重/平均對(duì)照組瘤重）}×100%；胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體重；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體重；肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體重。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.結(jié)果

2.1 抑瘤作用

研究結(jié)果顯示，與模型組比較，落地生根水提物中、高劑量組可明顯抑制小鼠H22實(shí)體瘤生長(zhǎng)（P＜0.05)，抑瘤率分別為65.68%和74.56%，與5－氟尿嘧啶作用相當(dāng)，見(jiàn)表1。

表1 落地生根水提物對(duì)小鼠瘤重及免疫臟器指數(shù)的影響

2.2 臟器/體重比值的測(cè)定

落地生根水提物各劑量組與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≥0.05)，落地生根水提物中、高劑量顯著增加H22荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)（P＜0.05)，中劑量組顯著增高胸腺指數(shù)（P＜0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2 肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的測(cè)定 （±s，mg·g-1）

表2 肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的測(cè)定 （±s，mg·g-1）

注：*表示P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)（只）肝臟指數(shù)脾臟指數(shù)胸腺指數(shù)空白組1062.42±2.12 7.79±1.19*6.94±0.81模型組1056.03±3.436.87±0.486.22±2.20陽(yáng)性組859.10±2.706.61±0.746.20±0.58低劑量組859.07±3.94 7.51±0.736.33±0.76中劑量組954.74±15.63 7.72±0.88* 7.21±0.88*高劑量組1060.20±1.857.77±0.83*6.32±1.26

2.3 小鼠碳廓清試驗(yàn)

落地生根水提物各劑量組小鼠碳廓清吞噬指數(shù)與模型組比較，中、高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，詳見(jiàn)表3。

表3 碳廓清試驗(yàn)（±s）

表3 碳廓清試驗(yàn)（±s）

注：*表示P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)（只）吞噬指數(shù)（a)空白組100.56±0.35模型組10 0.24±0.13陽(yáng)性組80.52±0.14*低劑量組80.39±0.15中劑量組90.47±0.21*高劑量組100.44±0.14*

3.討論

近年來(lái)，中醫(yī)藥的應(yīng)用在原發(fā)性肝癌的綜合治療中起著舉足輕重的作用，越來(lái)越多的有效抗癌成份已從中藥材中提取獲得，中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡時(shí)，其對(duì)正常細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)低于化療藥物，對(duì)正常組織細(xì)胞傷害很小，能改善患者全身癥狀，提高患者生存質(zhì)量，與化療藥物合用具有減毒增效的作用，同時(shí)，許多具有抗腫瘤作用的中藥在治療腫瘤的同時(shí)又能積極保護(hù)或增強(qiáng)免疫功能[4,5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn)落地生根水提物具有抗腫瘤及增強(qiáng)免疫功能作用。

脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)能夠反映機(jī)體非特異性免疫能力[6]。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的落地生根水提物作用于H22荷瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)中、高劑量可以增加H22荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)（P＜0.05)，中劑量顯著增高胸腺指數(shù)（P＜0.05)，能夠提高荷瘤小鼠的非特異性免疫能力，對(duì)免疫器官有一定的保護(hù)作用。中、高劑量落地生根水提物能夠有效抑制H22荷瘤小鼠的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，與陽(yáng)性藥5－氟尿嘧啶作用效果相當(dāng)。碳廓清試是檢測(cè)機(jī)體非特異性免疫功能的常用方法之一，顆粒狀異物進(jìn)入血液循環(huán)后，能迅速被巨噬細(xì)胞吞噬，若將異特量恒定，測(cè)定異物在血液中的消除速率可以反映巨噬細(xì)胞的吞噬功能[7]，本研究結(jié)果顯示落地生根水提物的中、高劑量組均可增加碳廓清指數(shù)，反映其可以調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。

綜上所述，落地生根水提物對(duì)H22荷瘤小鼠的免疫系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用，能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高抗腫瘤能力，具體的作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。