劉元 周俊 崔曉利 黃芳 雷佳媛 黨麗云
結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病仍然是嚴(yán)重危害人類健康的重大公共衛(wèi)生問題,WHO估算2017年我國新發(fā)結(jié)核病患者88.9萬例,結(jié)核病患者對利福平的耐藥率位居全球第二,僅次于印度[1]。結(jié)核病患者對異煙肼的耐藥率同樣不容忽視[2],Tan等[3]的一項多中心研究顯示:廣州、上海、安徽和西安4個地區(qū)對異煙肼的平均耐藥率為25.1%,而該研究中4個地區(qū)對利福平的平均耐藥率為19.0%。鑒于目前的結(jié)核病疫情,迫切需要一種能快速檢測出MTB及其對利福平和異煙肼耐藥性的方法。
二代線性探針[GenoType MTBDRplus VER 2.0(簡稱“MTBDRplus 2.0”)]技術(shù)是一種快速檢測疑似肺結(jié)核患者臨床標(biāo)本中MTB及其對利福平和異煙肼耐藥性的分子探針技術(shù),其采用多條分子探針分別覆蓋了rpoB基因核心突變區(qū)(RRDR)及katG和inhA基因的主要突變位點,通過雜交顯色可以在6 h內(nèi)獲得患者藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結(jié)果;其一代產(chǎn)品MTBDRplus在2008年獲得WHO推薦用于涂陽肺結(jié)核患者的耐藥診斷,在全球范圍已廣泛應(yīng)用[4-5]。和一代產(chǎn)品相比,MTBDRplus 2.0極大地提高了檢測的敏感度,可直接用于疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的檢測。目前,MTBDRplus 2.0用于臨床檢測的報道還較少[6]。本研究收集西安市胸科醫(yī)院疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本,同時進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)檢測、MTBDRplus 2.0檢測、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960液體培養(yǎng)”)和BACTEC MGIT 960藥敏試驗(簡稱“MGIT 960藥敏試驗”),以評價MTBDRplus 2.0技術(shù)對疑似肺結(jié)核與耐多藥結(jié)核病患者的診斷價值。
1.收集2018年1—12月在西安市胸科醫(yī)院就診的1065例疑似肺結(jié)核患者作為研究對象,其中初治患者836例,復(fù)治患者229例,年齡10~80歲,中位年齡40.0歲。1065例疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中,MGIT 960液體培養(yǎng)痰標(biāo)本污染32例,痰標(biāo)本培養(yǎng)陽性者經(jīng)鑒定為非結(jié)核分枝桿菌10例;GeneXpert檢測結(jié)果錯誤18例,利福平藥敏試驗結(jié)果不確定4例;MTBDRplus 2.0檢測時痰標(biāo)本污染26例,利福平或異煙肼藥敏試驗結(jié)果不確定者共6例,最終可用于分析的患者共969例。
2.患者的納入標(biāo)準(zhǔn):(1)疑似肺結(jié)核(具有結(jié)核臨床癥狀:咳嗽、咳痰≥2周,持續(xù)發(fā)熱、盜汗、體質(zhì)量下降等);(2)胸部X線攝影或CT掃描提示肺結(jié)核可能;(3)HIV陽性不予排除,可納入本研究。
3.患者的排除標(biāo)準(zhǔn):針對目前病情已進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療超過3周(不包括既往患結(jié)核病有治療史者)的患者。
所有患者痰標(biāo)本量不少于2 ml,每例患者用同一份痰標(biāo)本同時進(jìn)行GeneXpert檢測、MTBDRplus 2.0檢測、MGIT 960液體培養(yǎng),對培養(yǎng)陽性且鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌株進(jìn)行MGIT 960藥敏試驗。
1.標(biāo)本前處理:采用中和離心法去污染處理,取疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本2 ml,加入2倍體積N-乙酰-L-半胱胺酸(NALC)-NaOH消化液處理15 min,加磷酸鹽緩沖液(PBS)至40 ml,在4 ℃下3000×g離心20 min,棄上清液,沉淀加入1.5 ml PBS振蕩重懸。重懸后的痰標(biāo)本各取0.5 ml分別進(jìn)行MGIT 960液體培養(yǎng)、GeneXpert檢測及MTBDRplus 2.0檢測。
2.MGIT 960液體培養(yǎng):參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》及MGIT 960液體培養(yǎng)操作手冊進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作。取0.5 ml前處理后的標(biāo)本加入MGIT 960培養(yǎng)管中,放入MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)。一旦MGIT 960培養(yǎng)管通過儀器報告呈陽性,則使用痰涂片鏡檢確認(rèn)陽性產(chǎn)物,并用MPT64快速抗原檢測試劑確認(rèn)陽性產(chǎn)物為MTB。
3.MGIT 960藥敏試驗:取MTB陽性產(chǎn)物0.5 ml 接種到含藥培養(yǎng)基上(利福平藥物濃度1 μg/ml,異煙肼藥物濃度0.1 μg/ml)。另取0.2 ml陽性產(chǎn)物用PBS稀釋100倍后,取0.5 ml接種到生長對照管中,放入MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)。當(dāng)生長對照管中生長單位(growth unit,GU)指數(shù)達(dá)到400時(4~13 d內(nèi)),評估含藥培養(yǎng)管的GU值;含藥培養(yǎng)管的GU值<100為敏感,含藥培養(yǎng)管的GU值≥100為耐藥。
4.GeneXpert檢測:依據(jù)GeneXpert檢測說明書進(jìn)行。取0.5 ml前處理后的標(biāo)本至螺蓋管中并加入1.5 ml標(biāo)本處理液,渦旋振蕩30 s,室溫靜置15 min,再將樣本轉(zhuǎn)移至GeneXpert試劑盒后放入擴增儀器的樣本艙中進(jìn)行檢測。
5.MTBDRplus 2.0檢測:實驗在4個獨立房間進(jìn)行,包括試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、擴增區(qū)和雜交區(qū)。本研究嚴(yán)格按照MTBDRplus 2.0說明書,取0.5 ml前處理后的痰標(biāo)本采用10 000×g離心15 min,棄上清,加入100 μl裂解液(A-LYS),95 ℃水浴5 min,再次采用10 000×g離心1 min;加入100 μl中和緩沖液(A-NB)后,又一次采用10 000×g離心5 min,上清即為提取的核酸DNA。取5 μl提取后的DNA加入含有35 μl AM-B和10 μl AM-A的擴增體系中,按照說明書的擴增程序進(jìn)行擴增。擴增完成后取20 μl擴增產(chǎn)物進(jìn)行雜交,雜交過程包括化學(xué)變性、雜交孵育、洗滌、偶聯(lián)和顯色等。根據(jù)顯色結(jié)果進(jìn)行耐藥情況的判讀。判讀標(biāo)準(zhǔn):野生條帶均顯色且突變條帶無顯色時為敏感,野生條帶有缺失或突變條帶顯色為耐藥。
GeneXpert擴增檢測儀(美國Cepheid公司);MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)(美國BD公司);GT-blot 48雜交儀(法國梅里埃公司)。GeneXpert檢測試劑盒(美國Cepheid公司);MGIT 960液體培養(yǎng)管及分枝桿菌藥敏試驗檢測試劑盒(美國BD公司);MTBDRplus 2.0檢測試劑盒(法國梅里埃公司)。
采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。以MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn),分析MTBDRplus 2.0技術(shù)檢測疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中MTB的效能;以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),分析MTBDRplus 2.0技術(shù)檢測MTB對利福平和異煙肼耐藥性的效能。各項指標(biāo)計算方法:敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%;特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%;陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%;陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%;一致性檢驗采用Kappa檢驗,Kappa值≥0.75時認(rèn)為兩者一致性較好。
969例疑似肺結(jié)核患者中,MGIT 960液體培養(yǎng)檢測MTB陽性409例,陰性560例。以MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn),MTBDRplus 2.0檢測疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中MTB的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和Kappa值分別為91.0% (372/409)、93.8% (525/560)、91.4% (372/407)、93.4% (525/562)和0.848;MTBDRplus 2.0與MGIT 960液體培養(yǎng)檢測結(jié)果具有較好的一致性。GeneXpert檢測痰標(biāo)本中MTB的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和Kappa值分別為92.9% (380/409)、92.5% (518/560)、90.0% (380/422)、94.7% (518/547)和0.850;GeneXpert與MGIT 960液體培養(yǎng)檢測結(jié)果也具有較好的一致性(表1)。
表1 以MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評價MTBDRplus 2.0和GeneXpert技術(shù)檢測痰標(biāo)本中MTB的效能
969例疑似肺結(jié)核患者中,MTBDRplus 2.0、MGIT 960液體培養(yǎng)和GeneXpert檢測MTB均陽性的患者有367例,經(jīng)MGIT 960藥敏試驗檢測對利福平耐藥者59例,敏感者308例。以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),MTBDRplus 2.0和GeneXpert檢測MTB對利福平耐藥的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、Kappa值見表2。Kappa檢驗顯示,MTBDRplus 2.0和GeneXpert檢測MTB對利福平耐藥的結(jié)果與MGIT 960藥敏試驗結(jié)果均具有較好的一致性。同時對MTBDRplus 2.0和GeneXpert兩種分子藥敏試驗檢測結(jié)果進(jìn)行了比較,兩種分子藥敏試驗檢測MTB對利福平是否耐藥的結(jié)果中共有7例不一致:其中4例GeneXpert檢測結(jié)果為耐藥(其中2例荷菌量水平為“極低”)而MTBDRplus 2.0檢測結(jié)果為敏感,3例GeneXpert檢測結(jié)果為敏感而MTBDRplus 2.0檢測結(jié)果為耐藥。
表2 以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評價MTBDRplus 2.0和GeneXpert技術(shù)檢測MTB對利福平耐藥性的效能
969例疑似肺結(jié)核患者中,MTBDRplus 2.0與MGIT 960液體培養(yǎng)檢測結(jié)果均為MTB陽性的患者為372例,經(jīng)MGIT 960藥敏試驗對異煙肼敏感者270例,耐藥者102例。102例耐藥患者中有51例同時對利福平耐藥,另51例只對異煙肼耐藥,對異煙肼耐藥同時對利福平敏感患者的檢出率為13.7% (51/372)。以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),MTBDRplus 2.0檢測異煙肼耐藥性的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和Kappa值見表3。Kappa檢驗顯示,MTBDRplus 2.0檢測MTB對異煙肼的耐藥性與MGIT 960液體藥敏試驗結(jié)果具有較好的一致性。
表3 以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評價MTBDRplus 2.0技術(shù)檢測MTB對異煙肼耐藥性的效能
MTBDRplus 2.0技術(shù)是一種快速檢測疑似肺結(jié)核患者臨床標(biāo)本中MTB及其對利福平和異煙肼耐藥情況的分子生物學(xué)檢測方法。MTBDRplus 2.0在其一代試劑的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對DNA提取方法及PCR擴增體系進(jìn)行了優(yōu)化,極大地提高了檢測的敏感度。本研究以MGIT 960液體培養(yǎng)和MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),對MTBDRplus 2.0技術(shù)檢測痰標(biāo)本中MTB及其對利福平和異煙肼耐藥性的效能進(jìn)行了分析。
969例疑似肺結(jié)核患者中,以MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn),MTBDRplus 2.0檢測疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本MTB的敏感度為91.0%,特異度為93.8%,這與王洪秀等[7]的報道相似。GeneXpert技術(shù)是WHO推薦的用于肺結(jié)核診斷的快速分子檢測方法,本研究中GeneXpert檢測的敏感度和特異度分別為92.9%和92.5%,可以看出MTBDRplus 2.0技術(shù)與GeneXpert技術(shù)對于疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中MTB的檢測具有同等效能。
本研究中,MGIT 960藥敏試驗檢測利福平耐藥的59例患者中,MTBDRplus 2.0檢測耐藥53例,敏感6例;MGIT 960藥敏試驗檢測敏感的308例患者中,MTBDRplus 2.0檢測敏感295例,耐藥13例。這與國內(nèi)外的檢測結(jié)果大體接近[3,8]。本研究中MTBDRplus 2.0與GeneXpert對利福平耐藥性檢測的敏感度和特異度相差不大,但對比兩種分子方法檢測結(jié)果仍有7例不一致,7例中有2例GeneXpert檢測顯示其菌量水平為“極低”且顯示其耐藥,而MTBDRplus 2.0檢測敏感,可能為GeneXpert檢測的假耐藥結(jié)果,這在文獻(xiàn)[9-10]中均有論述;另外5例不一致的標(biāo)本中,2例標(biāo)本GeneXpert檢測為利福平耐藥而MTBDRplus 2.0檢測敏感,3例標(biāo)本GeneXpert檢測敏感而MTBDRplus 2.0檢測耐藥,分析其原因可能由于兩種方法檢測原理的差異造成:GeneXpert方法不能直接檢測出突變位點,只能通過野生型探針信號的減弱或缺失來判斷耐藥,在遇到異質(zhì)性耐藥[11]標(biāo)本時需要突變株具有較高的比例;GeneXpert檢測出利福平耐藥所需突變株的比例至少為40%[12]。而MTBDRplus 2.0方法則既可以對野生型基因進(jìn)行顯色,又可以對主要的突變位點D516V(rpoBMUT1)、H526Y(rpoBMUT2A)、H526D(rpoBMUT2B)、S531L(rpoBMUT3)進(jìn)行顯色,在異質(zhì)性耐藥的情況下,如果突變菌株具有的是MTBDRplus 2.0所涵蓋的突變位點,則MTBDRplus方法檢測耐藥時所需突變株的比例僅為5%[13],遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GeneXpert檢測出耐藥菌所需比例,故可能會出現(xiàn)MTBDRplus 2.0檢測耐藥而GeneXpert檢測敏感的情況;當(dāng)異質(zhì)性耐藥的突變株為MTBDRplus 2.0所涵蓋的突變位點以外的突變時,由于突變型條帶無法顯色,而野生型條帶只會減弱不會缺失,則MTBDRplus 2.0檢測在人工判讀時這種情況通常判讀為敏感,而對于GeneXpert檢測來說,該突變株的比例只要達(dá)到40%,就可以被檢測為耐藥,故可能出現(xiàn)GeneXpert檢測耐藥而MTBDRplus 2.0檢測敏感的情況,這與Rahman等[14]的研究結(jié)果也是符合的。
本研究中,MGIT 960藥敏試驗檢測對異煙肼耐藥的102例患者中,MTBDRplus 2.0檢測耐藥82例,敏感20例;MGIT 960藥敏試驗檢測敏感的270例患者中,MTBDRplus 2.0檢測敏感260例,耐藥10例。20例標(biāo)本MGIT 960藥敏試驗檢測為對異煙肼耐藥而MTBDRplus 2.0檢測為敏感,這是由于MTBDRplus 2.0方法僅檢測了katG和inhA基因的突變,并未包含ahpC、kasA、ndh基因造成的突變[15-16];另外,在同時存在敏感株和耐藥株的標(biāo)本中,MGIT 960藥敏試驗檢測耐藥所需耐藥株的比率僅為1%,而MTBDRplus 2.0檢出耐藥株所需的比率則至少需要5%[13],也可能是導(dǎo)致這一情況的原因。有10例標(biāo)本MGIT 960藥敏試驗檢測結(jié)果為對異煙肼敏感而MTBDRplus 2.0檢測為耐藥,可能是katG或inhA基因突變導(dǎo)致的低水平耐藥造成的。
本研究中對異煙肼耐藥同時對利福平敏感患者的檢出率為13.7%,這部分患者如果僅使用GeneXpert進(jìn)行檢測將只能獲得對利福平敏感的信息,無法獲知對異煙肼耐藥的情況,而等待MGIT 960藥敏試驗檢測結(jié)果將需要1個月左右的時間,這種情況下如果采用含異煙肼的方案治療,不但會影響治療效果,甚至有可能造成對其他聯(lián)合用藥藥品的耐藥。而如果使用MTBDRplus 2.0技術(shù)進(jìn)行檢測,將能在第一時間獲知對異煙肼耐藥的信息,便于臨床醫(yī)生及時調(diào)整治療方案,使患者得到更好的治療。
綜上,MTBDRplus 2.0檢測技術(shù)能夠快速高效地檢測出肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中的MTB及其對利福平和異煙肼是否耐藥的情況,與MGIT 960液體培養(yǎng)及藥敏試驗和GeneXpert檢測具有同等的檢測效力,可以應(yīng)用于肺結(jié)核患者的早期耐藥性篩查。MTBDRplus 2.0檢測與GeneXpert檢測相比,檢測時限相差不大,卻能同時獲得對異煙肼耐藥與否的結(jié)果,在現(xiàn)今的耐藥結(jié)核病疫情下,具有重要的臨床意義。但MTBDRplus 2.0檢測在實驗過程中容易污染,需要對實驗室進(jìn)行嚴(yán)格的分區(qū),同時人工判讀容易出現(xiàn)誤差,對實驗室操作人員的水平具有較高的要求,這是其不利于進(jìn)行廣泛推廣的因素。另外,在本研究中,筆者未對痰標(biāo)本以外的其他類型的臨床標(biāo)本進(jìn)行分析,將在后續(xù)的工作中開展進(jìn)一步的研究。