劉元 周俊 崔曉利 黃芳 雷佳媛 黨麗云

結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病仍然是嚴(yán)重危害人類健康的重大公共衛(wèi)生問題，WHO估算2017年我國新發(fā)結(jié)核病患者88.9萬例，結(jié)核病患者對利福平的耐藥率位居全球第二，僅次于印度[1]。結(jié)核病患者對異煙肼的耐藥率同樣不容忽視[2]，Tan等[3]的一項多中心研究顯示：廣州、上海、安徽和西安4個地區(qū)對異煙肼的平均耐藥率為25.1%，而該研究中4個地區(qū)對利福平的平均耐藥率為19.0%。鑒于目前的結(jié)核病疫情，迫切需要一種能快速檢測出MTB及其對利福平和異煙肼耐藥性的方法。

二代線性探針[GenoType MTBDRplus VER 2.0(簡稱“MTBDRplus 2.0”)]技術(shù)是一種快速檢測疑似肺結(jié)核患者臨床標(biāo)本中MTB及其對利福平和異煙肼耐藥性的分子探針技術(shù)，其采用多條分子探針分別覆蓋了rpoB基因核心突變區(qū)(RRDR)及katG和inhA基因的主要突變位點，通過雜交顯色可以在6 h內(nèi)獲得患者藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結(jié)果；其一代產(chǎn)品MTBDRplus在2008年獲得WHO推薦用于涂陽肺結(jié)核患者的耐藥診斷，在全球范圍已廣泛應(yīng)用[4-5]。和一代產(chǎn)品相比，MTBDRplus 2.0極大地提高了檢測的敏感度，可直接用于疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的檢測。目前，MTBDRplus 2.0用于臨床檢測的報道還較少[6]。本研究收集西安市胸科醫(yī)院疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，同時進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)檢測、MTBDRplus 2.0檢測、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960液體培養(yǎng)”)和BACTEC MGIT 960藥敏試驗(簡稱“MGIT 960藥敏試驗”)，以評價MTBDRplus 2.0技術(shù)對疑似肺結(jié)核與耐多藥結(jié)核病患者的診斷價值。

材料和方法

一、研究對象

1.收集2018年1—12月在西安市胸科醫(yī)院就診的1065例疑似肺結(jié)核患者作為研究對象，其中初治患者836例，復(fù)治患者229例，年齡10～80歲，中位年齡40.0歲。1065例疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中，MGIT 960液體培養(yǎng)痰標(biāo)本污染32例，痰標(biāo)本培養(yǎng)陽性者經(jīng)鑒定為非結(jié)核分枝桿菌10例；GeneXpert檢測結(jié)果錯誤18例，利福平藥敏試驗結(jié)果不確定4例；MTBDRplus 2.0檢測時痰標(biāo)本污染26例，利福平或異煙肼藥敏試驗結(jié)果不確定者共6例，最終可用于分析的患者共969例。

2.患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)疑似肺結(jié)核(具有結(jié)核臨床癥狀：咳嗽、咳痰≥2周，持續(xù)發(fā)熱、盜汗、體質(zhì)量下降等)；(2)胸部X線攝影或CT掃描提示肺結(jié)核可能；(3)HIV陽性不予排除，可納入本研究。

3.患者的排除標(biāo)準(zhǔn)：針對目前病情已進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療超過3周(不包括既往患結(jié)核病有治療史者)的患者。

二、試驗方法

所有患者痰標(biāo)本量不少于2 ml，每例患者用同一份痰標(biāo)本同時進(jìn)行GeneXpert檢測、MTBDRplus 2.0檢測、MGIT 960液體培養(yǎng)，對培養(yǎng)陽性且鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌株進(jìn)行MGIT 960藥敏試驗。

1.標(biāo)本前處理：采用中和離心法去污染處理，取疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本2 ml，加入2倍體積N-乙酰-L-半胱胺酸(NALC)-NaOH消化液處理15 min，加磷酸鹽緩沖液(PBS)至40 ml，在4 ℃下3000×g離心20 min，棄上清液，沉淀加入1.5 ml PBS振蕩重懸。重懸后的痰標(biāo)本各取0.5 ml分別進(jìn)行MGIT 960液體培養(yǎng)、GeneXpert檢測及MTBDRplus 2.0檢測。

2.MGIT 960液體培養(yǎng)：參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》及MGIT 960液體培養(yǎng)操作手冊進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作。取0.5 ml前處理后的標(biāo)本加入MGIT 960培養(yǎng)管中，放入MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)。一旦MGIT 960培養(yǎng)管通過儀器報告呈陽性，則使用痰涂片鏡檢確認(rèn)陽性產(chǎn)物，并用MPT64快速抗原檢測試劑確認(rèn)陽性產(chǎn)物為MTB。

3.MGIT 960藥敏試驗：取MTB陽性產(chǎn)物0.5 ml 接種到含藥培養(yǎng)基上(利福平藥物濃度1 μg/ml，異煙肼藥物濃度0.1 μg/ml)。另取0.2 ml陽性產(chǎn)物用PBS稀釋100倍后，取0.5 ml接種到生長對照管中，放入MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)。當(dāng)生長對照管中生長單位(growth unit，GU)指數(shù)達(dá)到400時(4～13 d內(nèi))，評估含藥培養(yǎng)管的GU值；含藥培養(yǎng)管的GU值<100為敏感，含藥培養(yǎng)管的GU值≥100為耐藥。

4.GeneXpert檢測：依據(jù)GeneXpert檢測說明書進(jìn)行。取0.5 ml前處理后的標(biāo)本至螺蓋管中并加入1.5 ml標(biāo)本處理液，渦旋振蕩30 s，室溫靜置15 min，再將樣本轉(zhuǎn)移至GeneXpert試劑盒后放入擴增儀器的樣本艙中進(jìn)行檢測。

5.MTBDRplus 2.0檢測：實驗在4個獨立房間進(jìn)行，包括試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、擴增區(qū)和雜交區(qū)。本研究嚴(yán)格按照MTBDRplus 2.0說明書，取0.5 ml前處理后的痰標(biāo)本采用10 000×g離心15 min，棄上清，加入100 μl裂解液(A-LYS)，95 ℃水浴5 min，再次采用10 000×g離心1 min；加入100 μl中和緩沖液(A-NB)后，又一次采用10 000×g離心5 min，上清即為提取的核酸DNA。取5 μl提取后的DNA加入含有35 μl AM-B和10 μl AM-A的擴增體系中，按照說明書的擴增程序進(jìn)行擴增。擴增完成后取20 μl擴增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，雜交過程包括化學(xué)變性、雜交孵育、洗滌、偶聯(lián)和顯色等。根據(jù)顯色結(jié)果進(jìn)行耐藥情況的判讀。判讀標(biāo)準(zhǔn)：野生條帶均顯色且突變條帶無顯色時為敏感，野生條帶有缺失或突變條帶顯色為耐藥。

三、儀器與試劑

GeneXpert擴增檢測儀(美國Cepheid公司)；MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)(美國BD公司)；GT-blot 48雜交儀(法國梅里埃公司)。GeneXpert檢測試劑盒(美國Cepheid公司)；MGIT 960液體培養(yǎng)管及分枝桿菌藥敏試驗檢測試劑盒(美國BD公司)；MTBDRplus 2.0檢測試劑盒(法國梅里埃公司)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。以MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，分析MTBDRplus 2.0技術(shù)檢測疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中MTB的效能；以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，分析MTBDRplus 2.0技術(shù)檢測MTB對利福平和異煙肼耐藥性的效能。各項指標(biāo)計算方法：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致性檢驗采用Kappa檢驗，Kappa值≥0.75時認(rèn)為兩者一致性較好。

結(jié) 果

一、痰標(biāo)本中MTB檢測結(jié)果分析

969例疑似肺結(jié)核患者中，MGIT 960液體培養(yǎng)檢測MTB陽性409例，陰性560例。以MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus 2.0檢測疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中MTB的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和Kappa值分別為91.0% (372/409)、93.8% (525/560)、91.4% (372/407)、93.4% (525/562)和0.848；MTBDRplus 2.0與MGIT 960液體培養(yǎng)檢測結(jié)果具有較好的一致性。GeneXpert檢測痰標(biāo)本中MTB的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和Kappa值分別為92.9% (380/409)、92.5% (518/560)、90.0% (380/422)、94.7% (518/547)和0.850；GeneXpert與MGIT 960液體培養(yǎng)檢測結(jié)果也具有較好的一致性(表1)。

表1 以MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評價MTBDRplus 2.0和GeneXpert技術(shù)檢測痰標(biāo)本中MTB的效能

二、3種方法對利福平耐藥性檢測的結(jié)果分析

969例疑似肺結(jié)核患者中，MTBDRplus 2.0、MGIT 960液體培養(yǎng)和GeneXpert檢測MTB均陽性的患者有367例，經(jīng)MGIT 960藥敏試驗檢測對利福平耐藥者59例，敏感者308例。以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus 2.0和GeneXpert檢測MTB對利福平耐藥的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、Kappa值見表2。Kappa檢驗顯示，MTBDRplus 2.0和GeneXpert檢測MTB對利福平耐藥的結(jié)果與MGIT 960藥敏試驗結(jié)果均具有較好的一致性。同時對MTBDRplus 2.0和GeneXpert兩種分子藥敏試驗檢測結(jié)果進(jìn)行了比較，兩種分子藥敏試驗檢測MTB對利福平是否耐藥的結(jié)果中共有7例不一致：其中4例GeneXpert檢測結(jié)果為耐藥(其中2例荷菌量水平為“極低”)而MTBDRplus 2.0檢測結(jié)果為敏感，3例GeneXpert檢測結(jié)果為敏感而MTBDRplus 2.0檢測結(jié)果為耐藥。

表2 以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評價MTBDRplus 2.0和GeneXpert技術(shù)檢測MTB對利福平耐藥性的效能

三、MTB對異煙肼耐藥性檢測結(jié)果分析

969例疑似肺結(jié)核患者中，MTBDRplus 2.0與MGIT 960液體培養(yǎng)檢測結(jié)果均為MTB陽性的患者為372例，經(jīng)MGIT 960藥敏試驗對異煙肼敏感者270例，耐藥者102例。102例耐藥患者中有51例同時對利福平耐藥，另51例只對異煙肼耐藥，對異煙肼耐藥同時對利福平敏感患者的檢出率為13.7% (51/372)。以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus 2.0檢測異煙肼耐藥性的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和Kappa值見表3。Kappa檢驗顯示，MTBDRplus 2.0檢測MTB對異煙肼的耐藥性與MGIT 960液體藥敏試驗結(jié)果具有較好的一致性。

表3 以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評價MTBDRplus 2.0技術(shù)檢測MTB對異煙肼耐藥性的效能

討 論

MTBDRplus 2.0技術(shù)是一種快速檢測疑似肺結(jié)核患者臨床標(biāo)本中MTB及其對利福平和異煙肼耐藥情況的分子生物學(xué)檢測方法。MTBDRplus 2.0在其一代試劑的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對DNA提取方法及PCR擴增體系進(jìn)行了優(yōu)化，極大地提高了檢測的敏感度。本研究以MGIT 960液體培養(yǎng)和MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，對MTBDRplus 2.0技術(shù)檢測痰標(biāo)本中MTB及其對利福平和異煙肼耐藥性的效能進(jìn)行了分析。

969例疑似肺結(jié)核患者中，以MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus 2.0檢測疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本MTB的敏感度為91.0%，特異度為93.8%，這與王洪秀等[7]的報道相似。GeneXpert技術(shù)是WHO推薦的用于肺結(jié)核診斷的快速分子檢測方法，本研究中GeneXpert檢測的敏感度和特異度分別為92.9%和92.5%，可以看出MTBDRplus 2.0技術(shù)與GeneXpert技術(shù)對于疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中MTB的檢測具有同等效能。

本研究中，MGIT 960藥敏試驗檢測利福平耐藥的59例患者中，MTBDRplus 2.0檢測耐藥53例，敏感6例；MGIT 960藥敏試驗檢測敏感的308例患者中，MTBDRplus 2.0檢測敏感295例，耐藥13例。這與國內(nèi)外的檢測結(jié)果大體接近[3,8]。本研究中MTBDRplus 2.0與GeneXpert對利福平耐藥性檢測的敏感度和特異度相差不大，但對比兩種分子方法檢測結(jié)果仍有7例不一致，7例中有2例GeneXpert檢測顯示其菌量水平為“極低”且顯示其耐藥，而MTBDRplus 2.0檢測敏感，可能為GeneXpert檢測的假耐藥結(jié)果，這在文獻(xiàn)[9-10]中均有論述；另外5例不一致的標(biāo)本中，2例標(biāo)本GeneXpert檢測為利福平耐藥而MTBDRplus 2.0檢測敏感，3例標(biāo)本GeneXpert檢測敏感而MTBDRplus 2.0檢測耐藥，分析其原因可能由于兩種方法檢測原理的差異造成：GeneXpert方法不能直接檢測出突變位點，只能通過野生型探針信號的減弱或缺失來判斷耐藥，在遇到異質(zhì)性耐藥[11]標(biāo)本時需要突變株具有較高的比例；GeneXpert檢測出利福平耐藥所需突變株的比例至少為40%[12]。而MTBDRplus 2.0方法則既可以對野生型基因進(jìn)行顯色，又可以對主要的突變位點D516V(rpoBMUT1)、H526Y(rpoBMUT2A)、H526D(rpoBMUT2B)、S531L(rpoBMUT3)進(jìn)行顯色，在異質(zhì)性耐藥的情況下，如果突變菌株具有的是MTBDRplus 2.0所涵蓋的突變位點，則MTBDRplus方法檢測耐藥時所需突變株的比例僅為5%[13]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GeneXpert檢測出耐藥菌所需比例，故可能會出現(xiàn)MTBDRplus 2.0檢測耐藥而GeneXpert檢測敏感的情況；當(dāng)異質(zhì)性耐藥的突變株為MTBDRplus 2.0所涵蓋的突變位點以外的突變時，由于突變型條帶無法顯色，而野生型條帶只會減弱不會缺失，則MTBDRplus 2.0檢測在人工判讀時這種情況通常判讀為敏感，而對于GeneXpert檢測來說，該突變株的比例只要達(dá)到40%，就可以被檢測為耐藥，故可能出現(xiàn)GeneXpert檢測耐藥而MTBDRplus 2.0檢測敏感的情況，這與Rahman等[14]的研究結(jié)果也是符合的。

本研究中，MGIT 960藥敏試驗檢測對異煙肼耐藥的102例患者中，MTBDRplus 2.0檢測耐藥82例，敏感20例；MGIT 960藥敏試驗檢測敏感的270例患者中，MTBDRplus 2.0檢測敏感260例，耐藥10例。20例標(biāo)本MGIT 960藥敏試驗檢測為對異煙肼耐藥而MTBDRplus 2.0檢測為敏感，這是由于MTBDRplus 2.0方法僅檢測了katG和inhA基因的突變，并未包含ahpC、kasA、ndh基因造成的突變[15-16]；另外，在同時存在敏感株和耐藥株的標(biāo)本中，MGIT 960藥敏試驗檢測耐藥所需耐藥株的比率僅為1%，而MTBDRplus 2.0檢出耐藥株所需的比率則至少需要5%[13]，也可能是導(dǎo)致這一情況的原因。有10例標(biāo)本MGIT 960藥敏試驗檢測結(jié)果為對異煙肼敏感而MTBDRplus 2.0檢測為耐藥，可能是katG或inhA基因突變導(dǎo)致的低水平耐藥造成的。

本研究中對異煙肼耐藥同時對利福平敏感患者的檢出率為13.7%，這部分患者如果僅使用GeneXpert進(jìn)行檢測將只能獲得對利福平敏感的信息，無法獲知對異煙肼耐藥的情況，而等待MGIT 960藥敏試驗檢測結(jié)果將需要1個月左右的時間，這種情況下如果采用含異煙肼的方案治療，不但會影響治療效果，甚至有可能造成對其他聯(lián)合用藥藥品的耐藥。而如果使用MTBDRplus 2.0技術(shù)進(jìn)行檢測，將能在第一時間獲知對異煙肼耐藥的信息，便于臨床醫(yī)生及時調(diào)整治療方案，使患者得到更好的治療。

綜上，MTBDRplus 2.0檢測技術(shù)能夠快速高效地檢測出肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中的MTB及其對利福平和異煙肼是否耐藥的情況，與MGIT 960液體培養(yǎng)及藥敏試驗和GeneXpert檢測具有同等的檢測效力，可以應(yīng)用于肺結(jié)核患者的早期耐藥性篩查。MTBDRplus 2.0檢測與GeneXpert檢測相比，檢測時限相差不大，卻能同時獲得對異煙肼耐藥與否的結(jié)果，在現(xiàn)今的耐藥結(jié)核病疫情下，具有重要的臨床意義。但MTBDRplus 2.0檢測在實驗過程中容易污染，需要對實驗室進(jìn)行嚴(yán)格的分區(qū)，同時人工判讀容易出現(xiàn)誤差，對實驗室操作人員的水平具有較高的要求，這是其不利于進(jìn)行廣泛推廣的因素。另外，在本研究中，筆者未對痰標(biāo)本以外的其他類型的臨床標(biāo)本進(jìn)行分析，將在后續(xù)的工作中開展進(jìn)一步的研究。