李靜 馬異峰 逄宇 王卓 王曉琳 封婧 仵倩紅

結(jié)核性腹膜炎(tuberculous peritonitis，TBP)是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種慢性彌漫性腹膜感染，是一種常見(jiàn)的腹腔結(jié)核，多繼發(fā)于腹膜外結(jié)核，占肺外結(jié)核的12%[1-2]，且伴隨著腹腔結(jié)核的增加而呈增多趨勢(shì)[3-6]。但因其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣、缺乏特異性、多并發(fā)其他疾病，且無(wú)確定性實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，易被漏診和誤診而延誤診治，故早期診斷TBP對(duì)有效治療和降低死亡率非常重要[7-8]。

傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)和病理學(xué)檢測(cè)一直是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但因抗酸桿菌(AFB)涂片鏡檢陽(yáng)性檢出率低、培養(yǎng)周期長(zhǎng)、病理取材有創(chuàng)傷，故尋求新的快速、準(zhǔn)確且高敏感度和高特異度的TBP診斷方法成為結(jié)核病檢測(cè)工作的重要目標(biāo)。盡管2013年GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“GeneXpert”)檢測(cè)作為新型分子診斷技術(shù)被WHO推薦用于肺外結(jié)核的診斷[9]，但其對(duì)腹腔積液中結(jié)核分枝桿菌的檢出率仍然很低[10]；而腺苷脫氨酶(ADA)檢測(cè)已被大量研究證實(shí)對(duì)于結(jié)核性胸腔積液、腦脊液和心包積液等肺外標(biāo)本也具有較高的輔助診斷價(jià)值[10-11]，但對(duì)腹腔積液的研究報(bào)道卻很少。筆者通過(guò)分析AFB涂片、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“MGIT 960培養(yǎng)”)、GeneXpert和ADA檢測(cè)對(duì)TBP的診斷效能，進(jìn)一步評(píng)估腹腔積液行ADA不同截?cái)嘀祵?duì)TBP的診斷價(jià)值。

資料和方法

一、研究對(duì)象

收集2016年1月至2018年12月陜西省結(jié)核病防治院和北京胸科醫(yī)院收治的203例疑似TBP患者腹腔積液標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)資料，納入同時(shí)采用抗酸桿菌金胺O染色涂片鏡檢(簡(jiǎn)稱“AFB涂片”)、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert和ADA檢測(cè)的119例疑似TBP患者，其中73例(61.3%)確診為TBP患者(TBP組)中，男36例(49.3%)、女37例(50.7%)；年齡范圍14～87歲，其中<25歲年齡組29例(39.7%)、25～歲年齡組17例(23.3%)、45～歲年齡組18例(24.7%)、65～87歲年齡組9例(12.3%)。46例(38.7%)確診為非結(jié)核性腹膜炎(非TBP組)患者，包括腺癌、鱗癌、低分化癌、結(jié)腸癌共計(jì)21例，肺結(jié)核并發(fā)非結(jié)核分枝桿菌病2例，急性血行播散性肺結(jié)核2例，繼發(fā)性肺結(jié)核3例，腸結(jié)核1例，結(jié)核性心包炎1例，結(jié)核性多漿膜腔積液6例，胸膜炎、腦膜炎共10例；其中男22例(47.8%)、女24例(52.2%)，年齡范圍19～85歲，其中<25歲年齡組4例(8.7%)、25～歲年齡組12例(26.1%)、45～歲年齡組17例(36.9%)、65～85歲年齡組13例(28.3%)。以臨床確診患者為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GereXpert和ADA檢測(cè)的檢測(cè)效能。

二、診斷標(biāo)準(zhǔn)[12-13]

1.疑似TBP診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)中青年患者，有結(jié)核病病史，并發(fā)其他器官結(jié)核病且診斷證據(jù)確鑿；(2)原因不明發(fā)熱達(dá)2周以上，伴有腹痛、腹脹、腹瀉、腹腔積液、腹壁柔韌感或腹部腫塊；(3)腹腔積液為滲出性，以淋巴細(xì)胞為主，普通細(xì)菌培養(yǎng)陰性，ADA檢測(cè)明顯高于臨床參考范圍；(4)結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)強(qiáng)陽(yáng)性或γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-γ release assay，IGRA)陽(yáng)性；(5)腹部X線攝影或CT掃描發(fā)現(xiàn)腹膜增厚、腸系膜結(jié)節(jié)、淋巴結(jié)增大、腸粘連等征象。符合以上臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)其中一項(xiàng)即為可疑TBP患者。

2.TBP確診標(biāo)準(zhǔn)：腹腔積液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性，或臨床診斷為疑似TBP患者經(jīng)試驗(yàn)性抗結(jié)核藥物治療2～4周有效。

3.其他疾病診斷：參照《內(nèi)科學(xué)》和臨床診療路徑，結(jié)合臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、影像學(xué)和病理學(xué)檢查，以及診斷性治療有效可確診。

三、主要試劑和儀器

抗酸染色試劑為自配金胺O染色試劑；BACTEC MGIT 960檢測(cè)系統(tǒng)所用的培養(yǎng)儀及試劑均由美國(guó)BD公司提供；GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)及配套試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Cepheid公司；腹腔積液ADA測(cè)定采用貝克曼AU 2700全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑檢測(cè)。

四、檢測(cè)方法

腹腔積液標(biāo)本按照無(wú)菌采集標(biāo)本的要求留取。

1.AFB涂片：嚴(yán)格按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[14]操作。將腹腔積液標(biāo)本靜置2～4 h，取沉淀部分約20～50 ml，3000×g離心20～30 min，取沉淀物涂片、干燥、抗酸染色鏡檢，按照檢驗(yàn)規(guī)程報(bào)告結(jié)果。

2.MGIT 960培養(yǎng)：嚴(yán)格按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[14]操作。取2 ml腹腔積液標(biāo)本經(jīng)N-乙酰-L-半胱胺酸-氫氧化鈉法(NALC-NaOH，終濃度為1.5%)消化去污處理后，室溫靜置15 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)中和(pH=6.8)后再3000×g離心15 min，棄上清，2 ml PBS緩沖液重懸沉淀物，取0.5 ml重懸液接種至MGIT 960培養(yǎng)管中，加入0.8 ml 營(yíng)養(yǎng)添加劑(OADC)和雜菌抑制劑(PANTA)的混合液，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。將接種好的MGIT 960培養(yǎng)管放入MGIT 960系統(tǒng)中孵育，儀器對(duì)分枝桿菌的生長(zhǎng)進(jìn)行自動(dòng)監(jiān)測(cè)。儀器報(bào)陽(yáng)后采用結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)試劑盒(MPB64)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的初步鑒定[15]。

3.GeneXpert檢測(cè)：嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行檢驗(yàn)。將1 ml腹腔積液標(biāo)本與2 ml GeneXpert系統(tǒng)前處理液混合，室溫靜置15 min。將消化后的2 ml樣品用無(wú)菌吸管吸入GeneXpert系統(tǒng)測(cè)試盒中，上機(jī)檢測(cè)，約2 h報(bào)告結(jié)果。

4.ADA測(cè)定：吸取腹腔積液標(biāo)本2 ml，3000×g離心5 min，直接放入全自動(dòng)生化儀進(jìn)行檢測(cè)(酶比色法)，自動(dòng)報(bào)告結(jié)果。正常參考范圍為40 U/L，本研究經(jīng)ROC曲線分析，確定在敏感度最大時(shí)的ADA測(cè)定值(31.45 U/L)為陽(yáng)性臨界值，以高于31.45 U/L為陽(yáng)性，低于31.45 U/L為陰性。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以臨床確診患者為參考標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert和ADA測(cè)定的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值、符合率。組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，ADA測(cè)定值的比較采用t檢驗(yàn)，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以ROC曲線分析ADA檢測(cè)的最佳臨界值，以ROC曲線下面積(AUC)評(píng)估檢測(cè)效能，AUC值越大，說(shuō)明檢測(cè)的診斷價(jià)值越大。當(dāng)AUC值接近0.50時(shí)表示檢測(cè)對(duì)診斷無(wú)臨床意義；AUC值為0.50～0.70時(shí)表示診斷準(zhǔn)確度較低；AUC值為0.70～0.90時(shí)表示診斷準(zhǔn)確度為中等；AUC值>0.90表示診斷準(zhǔn)確度較高。

結(jié) 果

一、不同檢測(cè)方法對(duì)TBP的檢出情況

119例疑似TPB患者中，AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert檢測(cè)疑似TBP患者的陽(yáng)性檢出者均為TPB患者，陽(yáng)性率分別為2.5% (3/119)、6.7% (8/119)、7.6% (9/119)，且MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert檢測(cè)TBP有6例患者是一致的；而ADA檢測(cè)疑似TBP患者的陽(yáng)性檢出率為58.8% (70/119)，但70例陽(yáng)性檢出者中TBP患者63例、非TBP患者7例。且63例TBP患者中ADA分別檢出55例MGIT 960培養(yǎng)和54例GeneXpert檢測(cè)陰性患者。

二、AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert、ADA檢測(cè)對(duì)TBP的檢測(cè)效能

119例疑似TPB患者中，以臨床確診患者為標(biāo)準(zhǔn)，不同檢測(cè)方法及ADA測(cè)定對(duì)TBP的檢測(cè)效能見(jiàn)表1，ADA的敏感度高于其他3種檢測(cè)方法。對(duì)ADA測(cè)定值進(jìn)行ROC曲線分析，顯示當(dāng)腹腔積液ADA陽(yáng)性臨界值為31.45 U/L時(shí)，敏感度為86.3% (63/73)，特異度為84.8%，AUC曲線下最大面積為0.836，見(jiàn)圖1。

圖1 ADA測(cè)定診斷TBP的ROC曲線

表1 不同檢測(cè)方法對(duì)TBP的檢測(cè)效能

三、ADA測(cè)定對(duì)TBP患者的檢測(cè)價(jià)值

TBP組的ADA陽(yáng)性檢出率(86.3%)、ADA的平均值水平[(67.66±8.59)U/L]均高于非TBP組[分別為15.2%,(17.34±2.76)U/L]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體見(jiàn)表2。

表2 ADA檢測(cè)結(jié)果對(duì)TBP患者和非TBP患者的檢測(cè)價(jià)值

討 論

TBP是由結(jié)核分枝桿菌引起的彌漫性腹膜感染，大多繼發(fā)于其他部位的結(jié)核病灶，包括腹腔病灶直接蔓延感染、血行感染，但臨床上多數(shù)患者無(wú)法找到原發(fā)病灶。TBP的診斷依賴于胸腔積液的病原學(xué)或病理學(xué)檢測(cè)，然而傳統(tǒng)的抗酸桿菌涂片鏡檢及培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率基本低至10%[16]，本研究中AFB涂片陽(yáng)性檢出率為2.5%，MGIT 960培養(yǎng)為6.7%，與上述研究相符，不利于TBP的診斷；且由于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的環(huán)境要求較高，傳統(tǒng)的L-J(羅氏)培養(yǎng)結(jié)果需45 d[17]，即使MGIT 960培養(yǎng)也至少需要2～3周[17-18]，均無(wú)法滿足臨床快速診治的需求。而GeneXpert作為新型分子診斷技術(shù)，其在肺外結(jié)核中的診斷價(jià)值已被多項(xiàng)研究評(píng)估[19-25]，認(rèn)為應(yīng)用GeneXpert檢測(cè)胸腔積液、腦脊液、尿液及骨關(guān)節(jié)結(jié)核部位膿液標(biāo)本具有較高的敏感度和檢測(cè)方法的優(yōu)越性，被認(rèn)為可用于肺外結(jié)核各種類型臨床標(biāo)本(如腦脊液和組織樣本)檢測(cè)的確證性診斷試驗(yàn)，但由于其檢測(cè)效果不理想，臨床中很少將其用于檢測(cè)疑似TBP患者的腹腔積液[26-27]，故缺乏對(duì)腹腔積液標(biāo)本的評(píng)估。本研究119例疑似TBP患者的腹腔積液標(biāo)本，GeneXpert陽(yáng)性檢出率很低，僅為7.6%，雖然稍高于AFB涂片和MGIT 960培養(yǎng)，但仍難以對(duì)TBP進(jìn)行輔助診斷，分析原因可能為抗酸染色涂片需抗酸桿菌達(dá)到5×103～1×104個(gè)/ml的濃度才能檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，而涂片樣本量一般難以達(dá)到檢測(cè)需求量；而MGIT 960培養(yǎng)對(duì)環(huán)境要求極高，前處理過(guò)程復(fù)雜、人為影響因素較多且最終加樣培養(yǎng)量?jī)H有較低的500 μl載菌量，也難有較高的檢出率；GeneXpert雖操作過(guò)程簡(jiǎn)單，但加樣量也只有1 ml，載菌量也較低[14]。另外，本研究中有2例培養(yǎng)陽(yáng)性但GeneXpert陰性的結(jié)果，這可能與GeneXpert主要檢測(cè)的是結(jié)核分枝桿菌的DNA，而MGIT 960培養(yǎng)主要檢測(cè)活的結(jié)核分枝桿菌，且MGIT 960培養(yǎng)與GeneXpert的細(xì)菌濃度陽(yáng)性閾值檢測(cè)限也不相同(前者為100個(gè)/ml，后者為131個(gè)/ml)。同時(shí)結(jié)果還顯示，MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert的檢測(cè)陽(yáng)性者有6例為同時(shí)陽(yáng)性，重疊比例較高。故認(rèn)為目前不建議應(yīng)用GeneXpert檢測(cè)腹腔積液，更無(wú)需進(jìn)行MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert的聯(lián)合檢測(cè)，如何高效應(yīng)用GeneXpert檢測(cè)腹腔積液標(biāo)本還需要進(jìn)一步研究。

抗結(jié)核感染免疫仍主要依賴細(xì)胞免疫。結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)使巨噬細(xì)胞活化、淋巴細(xì)胞增殖、巨噬細(xì)胞胞體內(nèi)溶酶體酶大量增多，并產(chǎn)生非保護(hù)性抗體，對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的殺傷力起到增強(qiáng)作用，故TBP是在腹膜感染結(jié)核分枝桿菌后而引起的一系列以淋巴細(xì)胞為免疫主導(dǎo)作用的變態(tài)反應(yīng)性疾病，由于臨床表現(xiàn)缺乏特異性，又常以腹腔積液為主要體征，故腹腔積液生物標(biāo)志物的檢測(cè)具有重要意義。ADA是嘌呤腺苷分解代謝過(guò)程中一種重要酶類，為特異性催化水解核苷生成肌苷核氨，在人體各器官組織中廣泛分布，尤其以淋巴細(xì)胞特別是T淋巴細(xì)胞中含量最高，且與T淋巴細(xì)胞分化程度呈正比。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌抗原刺激T淋巴細(xì)胞時(shí)，腹腔積液ADA活性增高[28]，故利用ADA測(cè)定可以反映結(jié)核分枝桿菌抗原的生化反應(yīng)，從而獲得結(jié)核分枝桿菌的載荷量，具有較高的診斷意義，被認(rèn)為是診斷TBP較為特異的指標(biāo)，但陽(yáng)性臨界值不同，其檢測(cè)的敏感度和特異度也不同，臨床上一般以ADA>40 U/L為陽(yáng)性臨界值。一項(xiàng)Meta分析顯示，當(dāng)以ADA>40 U/L為陽(yáng)性臨界值時(shí)，ADA診斷TBP的敏感度和特異度分別為93%和94%[29]；而Kang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以ADA>21 U/L 為最佳陽(yáng)性臨界值時(shí)，其檢測(cè)特異度及敏感度分別為85%和92%；另外，Riquelme等[31]的Meta 分析報(bào)道，當(dāng)以36～40 U/L為臨界值時(shí)，ADA檢測(cè)的敏感度和特異度最高，分別為100%和97%。本研究對(duì)ADA測(cè)定值進(jìn)行ROC曲線分析結(jié)果顯示，當(dāng)以ADA>31.45 U/L為陽(yáng)性臨界值時(shí)，檢測(cè)的敏感度和特異度分別為86.3%和84.8%，說(shuō)明相較于GeneXpert和MGIT 960培養(yǎng)，腹腔積液標(biāo)本中ADA的測(cè)定對(duì)診斷TBP具有較高的敏感度，可以識(shí)別大約86.3%的TBP患者，提示其在TBP的診斷中有較高的診斷價(jià)值，但較上述研究結(jié)果低，可能與檢測(cè)ADA的儀器所設(shè)定的陽(yáng)性界值不同、試劑來(lái)源不同、實(shí)驗(yàn)方法不同而影響TBP的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而影響其檢測(cè)的敏感度和特異度；而且，臨床上有些TBP患者在檢測(cè)ADA時(shí)已進(jìn)行診斷性抗結(jié)核藥物治療，使得腹腔積液中ADA水平有所降低，繼而影響其特異度。在臨床上TBP缺乏特異性臨床表現(xiàn)和體征，依據(jù)ADA水平的變化并結(jié)合抗結(jié)核藥物治療的效果可鑒別診斷TBP和其他疾病。本研究MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert檢測(cè)TBP陰性的患者中，ADA測(cè)定可檢出75.3% (55/73)和74.0% (54/73)的TBP患者，進(jìn)一步說(shuō)明ADA具有更好的檢測(cè)陽(yáng)性反應(yīng)。

本研究也存在一定的局限性。其一，雖然納入了兩家醫(yī)院的患者，但是TBP患者樣本量仍然較小。其二，有研究表明，與HIV初發(fā)患者相比，HIV感染患者的ADA水平可能較低[32]，但考慮到我國(guó)目前HIV感染報(bào)告率還較低，本研究未納入HIV陽(yáng)性患者進(jìn)行研究。

綜上所述，ADA測(cè)定對(duì)TBP早期診斷具有較高的敏感度和特異度，GeneXpert檢測(cè)腹腔積液標(biāo)本的陽(yáng)性率高于傳統(tǒng)的抗酸染色涂片鏡檢和培養(yǎng)，但因其檢測(cè)量只有1 ml，可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌荷菌量較低從而降低檢測(cè)敏感度。而ADA測(cè)定簡(jiǎn)單快速，與常規(guī)生化檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，當(dāng)天即可回報(bào)結(jié)果，適合所有開(kāi)展常規(guī)生化檢測(cè)的基層單位開(kāi)展，對(duì)患者的早期診斷，早期治療，避免不必要的檢查，節(jié)省大量醫(yī)療經(jīng)濟(jì)成本，降低漏診和死亡率意義重大。