黃芳 王勃 趙國連 王海東 黨麗云

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)是指除結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌等結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌總稱。NTM屬于機會致病菌，在自然界廣泛存在于城市供水系統(tǒng)、飲用水系統(tǒng)、灰塵和土壤等，僅少部分NTM對人體致病，可侵犯肺臟、淋巴結(jié)、骨骼、關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織等組織器官，并可引起全身播散性疾病。因NTM肺部感染的癥狀常與肺結(jié)核相似，易被誤診為結(jié)核分枝桿菌感染而延誤病情[1]。本研究對應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)對臨床常見的NTM肺病患者的T淋巴細(xì)胞變化情況進行研究，探討T淋巴細(xì)胞計數(shù)在結(jié)核病患者與NTM肺病患者中的差異，以輔助診斷NTM病。

對象和方法

一、患者來源

收集2013年1月至2019年3月西安市胸科醫(yī)院經(jīng)臨床綜合診斷確診的143例菌陽肺結(jié)核患者(肺結(jié)核組)、146例結(jié)核性胸膜炎患者(結(jié)核性胸膜炎組)、81例結(jié)核性腦膜炎患者(結(jié)核性腦膜炎組)、175例其他肺部疾病患者(對照組，包括細(xì)菌性肺炎101例、支原體肺炎58例、支氣管擴張癥11例、塵肺5例)，以及162例各類NTM肺病患者[NTM組，包括鳥-胞內(nèi)分枝桿菌(M.avium)病75例、龜-膿腫分枝桿菌(M．chelonea)病45例、戈登分枝桿菌(M．gordonae)病16例、堪薩斯分枝桿菌(M．kansasii)病17例、偶然分枝桿菌(M．fortuitum)病9例]。收集全部患者的T淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果，將NTM組與其他4組患者的T淋巴細(xì)胞變化情況進行比對分析，總結(jié)流式細(xì)胞學(xué)檢測NTM肺病患者的T淋巴細(xì)胞特點。

二、診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.結(jié)核病相關(guān)診斷：依據(jù)《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[2]，菌陽肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腦膜炎以病原學(xué)(包括分子生物學(xué)及細(xì)菌學(xué))、病理學(xué)檢查為確診依據(jù)，結(jié)合流行病史、臨床表現(xiàn)、胸部影像、相關(guān)輔助檢查進行臨床綜合診斷。(1)菌陽肺結(jié)核患者：有典型的肺結(jié)核臨床癥狀，胸部影像學(xué)提示結(jié)核病灶，病理學(xué)檢查可見結(jié)核病變，細(xì)菌學(xué)診斷中分枝桿菌痰涂片和培養(yǎng)均陽性，由于原發(fā)性結(jié)核病患者較少，本研究排除原發(fā)性結(jié)核病患者；(2)結(jié)核性腦膜炎患者：有結(jié)核中毒癥狀及顱內(nèi)高壓癥狀，伴有腦膜刺激征及其他神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征；腦脊液生化指標(biāo)腺苷脫氨酶(ADA)升高，腦脊液胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌涂陽或培陽，分子生物學(xué)檢測陽性，結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢查陽性，實驗室檢查滿足任意兩項即可；抗結(jié)核藥物治療有效的患者；(3)結(jié)核性胸膜炎患者：有胸膜炎的臨床體征，胸部影像學(xué)檢查或B超提示胸腔積液，胸膜表面可見結(jié)核病變；胸腔積液生化指標(biāo)ADA升高，結(jié)核分枝桿菌涂陽或培陽，分子生物學(xué)檢查陽性，T-SPOT.TB檢查陽性，實驗室檢查滿足任兩項即可；抗結(jié)核治療有效的患者。

2.其他肺部疾病患者：(1)支氣管擴張癥患者：有肺炎或支氣管肺炎病史，長期反復(fù)咳嗽甚至咯血，肺部有濕性啰音，影像學(xué)檢查可見肺紋理增粗增多，CT檢查可見擴張的支氣管，支持支氣管擴張癥診斷，抗結(jié)核藥物治療無效，結(jié)核病相關(guān)實驗室檢查不支持結(jié)核病診斷的患者；(2)塵肺患者：依據(jù)2015年頒布的《GBZ 70—2015職業(yè)性塵肺病的診斷》[3]標(biāo)準(zhǔn)，選取有確定職業(yè)性粉塵接觸史，對照塵肺診斷標(biāo)準(zhǔn)片，可見小陰影總體密度至少1級、分布范圍至少達到2個肺區(qū)，結(jié)合臨床表現(xiàn)及實驗室檢查排除其他肺部疾病的患者；(3)肺炎患者：有肺炎的臨床表現(xiàn)，體檢可有干濕性啰音，胸片有肺部浸潤影，白細(xì)胞計數(shù)檢查出現(xiàn)中性粒細(xì)胞增高或淋巴細(xì)胞增高，痰標(biāo)本普通菌培養(yǎng)陽性，支持細(xì)菌性肺炎診斷，若外周血支原體檢查陽性，則支持支原體肺炎診斷。

3.NTM肺病患者：依據(jù)《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療專家共識》[4]，由臨床高年資的醫(yī)師、影像學(xué)專家和細(xì)菌學(xué)專家共同診斷。具有呼吸系統(tǒng)癥狀和(或)全身癥狀，經(jīng)胸部影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)有空洞性陰影、多灶性支氣管擴張及多發(fā)性小結(jié)節(jié)病變等，已排除其他疾病，并在確保標(biāo)本無外源性污染的前提下，符合以下條件之一者可做出NTM肺病的診斷：(1)痰NTM培養(yǎng)2次均為同一致病菌；(2)肺泡灌洗液中NTM培養(yǎng)陽性1次，陽性級別為“++”以上；(3)肺泡灌洗液中NTM培養(yǎng)陽性1次，抗酸桿菌涂片陽性級別為“++”以上；(4)經(jīng)支氣管鏡或其他途徑的肺組織活檢，發(fā)現(xiàn)分枝桿菌病的組織病理學(xué)特征性改變(肉芽腫性炎癥或抗酸染色陽性)，并且NTM培養(yǎng)陽性；(5)肺組織活檢發(fā)現(xiàn)分枝桿菌病的組織病理學(xué)特征性改變(肉芽腫性炎癥或抗酸染色陽性)，并且痰標(biāo)本和(或)肺泡灌洗液中NTM培養(yǎng)陽性≥1次。NTM肺病不同菌種采用DNA微陣列芯片法進行菌種鑒定以確診。

三、研究方法

1.菌株涂片方法：采用萋-尼抗酸染色，按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[5]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行。一次性吸管吸取培養(yǎng)后菌液0.1 ml，于玻片中央涂抹成圓形菌液薄膜，自然干燥后進行萋-尼抗酸染色鏡檢。

2.菌株培養(yǎng)試驗方法：采用BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)方法，按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[5]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行。試劑來源：分枝桿菌培養(yǎng)管及分枝桿菌培養(yǎng)添加劑、試劑盒購自美國BD公司。具體方法為取處理好的痰液標(biāo)本0.5 ml加至MGIT液體培養(yǎng)管中，放入BACTEC MGITTM960液體培養(yǎng)系統(tǒng)中進行培養(yǎng)，報陽后取出。

3.菌種鑒定方法：采用DNA微陣列芯片法[6]檢測分枝桿菌培養(yǎng)陽性菌株進行分枝桿菌菌種鑒定。DNA微陣列芯片法試劑盒由成都博奧晶芯生物科技有限公司生產(chǎn)。從培養(yǎng)陽性菌液中提取分枝桿菌DNA，按照分枝桿菌菌種鑒定試劑盒說明書進行PCR擴增，再將擴增后的產(chǎn)物加入芯片，放入雜交儀雜交孵育后放入芯片洗滌儀洗滌芯片，最后應(yīng)用芯片掃描儀掃描判讀即可。掃描儀根據(jù)不同位點的熒光強度進行判讀，可同時快速檢測 17 種分枝桿菌，包括結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、土分枝桿菌、龜-膿腫分枝桿菌、草分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、金色分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌及恥垢分枝桿菌。

4.流式細(xì)胞學(xué)檢查方法：流式細(xì)胞儀型號為BD FACSCanto ⅡTM，BD Trucount Tube絕對計數(shù)管及淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒為美國BD公司生產(chǎn)。具體方法：采集患者外周靜脈血2 ml于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，取一支BD Trucount Tube絕對計數(shù)管加入50 μl充分混勻的抗凝全血，再加入20 μl異硫氰酸熒光素(BD Tritest CD4 FITC)/藻紅蛋白(CD8 PE)/多甲藻素葉綠素蛋白(CD3 PerCP)抗體試劑，輕輕渦旋振蕩混勻，在室溫下(20～25 ℃)避光孵育15 min，再向管中添加450 μl BD FACS溶血素，輕輕渦旋振蕩混勻，在室溫下(20～25 ℃)避光孵育15 min后放入流式細(xì)胞儀進行檢測。最后使用BD Multiset軟件確定絕對計數(shù)結(jié)果。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)方析。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]表示，采用非參數(shù)Kruskal-WaillsH檢驗比較5組患者，以及不同NTM肺病患者T淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、NTM組與其他4組流式細(xì)胞學(xué)檢查T淋巴細(xì)胞結(jié)果

本研究對NTM組、涂陽肺結(jié)核組、結(jié)核性胸膜炎組、結(jié)核性腦膜炎組、對照組患者的T淋巴細(xì)胞計數(shù)檢查結(jié)果進行對比分析，結(jié)果顯示除NTM組與對照組患者CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，5組患者間總T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞計數(shù)的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。見表1。

表1 各組研究對象T淋巴細(xì)胞計數(shù)的比較[個/μl，M(Q1，Q3)]

二、NTM 病的T淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞檢查結(jié)果

結(jié)果顯示，5種不同NTM 病的T淋巴細(xì)胞計數(shù)間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)(表2)。

表2 不同NTM病T淋巴細(xì)胞計數(shù)結(jié)果比較[個/μl，M(Q1，Q3)]

討 論

近年來NTM感染患者數(shù)呈增加趨勢，在被確診的結(jié)核病患者中的分離率為22.9%，且存在自南向北、自東向西逐漸降低的地域特點[7-8]。由于NTM的主要易感人群為免疫力低下或有肺部基礎(chǔ)疾病的患者[1]，且與肺結(jié)核的臨床癥狀及影像學(xué)表現(xiàn)極為相似，但治療方法完全不同，使得其與結(jié)核病的鑒別尤為重要。在抗結(jié)核免疫中，T淋巴細(xì)胞是機體免疫防御的關(guān)鍵，由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答決定了結(jié)核分枝桿菌和宿主間的相互作用，進而影響疾病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[9-10]。本研究應(yīng)用回顧性研究方法，總結(jié)NTM肺病的T淋巴細(xì)胞計數(shù)特點，結(jié)果顯示流式細(xì)胞學(xué)檢測NTM肺病患者T淋巴細(xì)胞計數(shù)對臨床診斷有輔助價值。

NTM病患者的T淋巴細(xì)胞主要通過CD4+T淋巴細(xì)胞等介導(dǎo)免疫反應(yīng)和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，主要分泌γ-干擾素(INF-γ)和白細(xì)胞介素-12(IL-12)等，激活中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以殺滅NTM[11-12]。而在結(jié)核病患者中結(jié)核分枝桿菌感染可顯著降低機體細(xì)胞免疫功能，表現(xiàn)在總T淋巴細(xì)胞計數(shù)下降，CD3+、CD4+、CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞均降低，而CD8+T升高[13]。本研究顯示，5組患者的T淋巴細(xì)胞計數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表現(xiàn)為對照組在總T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞計數(shù)中最高，其次為NTM組，3組結(jié)核病組較低；在CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞中NTM組和對照組計數(shù)較高，結(jié)核病組計數(shù)較低，提示T淋巴細(xì)胞在結(jié)核病患者中明顯降低，與文獻[13]報道一致；NTM患者T淋巴細(xì)胞計數(shù)高于結(jié)核病患者，但同時低于對照組患者，說明T淋巴細(xì)胞在NTM患者及不同肺部疾病患者體內(nèi)的免疫狀態(tài)不同。這可能與機體對于急性感染與慢性感染的免疫水平差異有關(guān)。有報道指出，在急性病毒感染后，抗原特異性記憶CD8+T淋巴細(xì)胞具有生物學(xué)功能，是保護性免疫的重要組成；而在慢性感染中，CD8+T淋巴細(xì)胞常常出現(xiàn)不同程度的特異性功能受損，這種受損可能是宿主不能及時有效清除病原體使其持續(xù)存在的主要原因[14]。

本研究也顯示，不同部位結(jié)核病患者中T淋巴細(xì)胞的降低幅度不一致，即結(jié)核性腦膜炎患者的各項T淋巴細(xì)胞計數(shù)最低，肺結(jié)核患者的總T淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)均高于結(jié)核性胸膜炎患者，但CD8+和CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞均低于結(jié)核性胸膜炎患者?？赡芘cT淋巴細(xì)胞是通過分泌細(xì)胞因子的相互作用來聯(lián)合調(diào)控形成結(jié)核感染的特殊感染灶微環(huán)境有關(guān)。在結(jié)核性胸膜炎患者中存在Th1/Th2免疫應(yīng)答功能紊亂[15-16]，當(dāng)以Th1細(xì)胞免疫占主導(dǎo)時，Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、INF-γ細(xì)胞因子，由于INF-γ可刺激機體產(chǎn)生活性氮介質(zhì)，進而激活巨噬細(xì)胞以清除胞內(nèi)菌并分泌趨化因子吸引炎性細(xì)胞向感染部位聚集，促進局部肉芽腫形成，有利于疾病治愈；而當(dāng)以Th2細(xì)胞免疫占主導(dǎo)時，由于Th2細(xì)胞主要通過分泌作用于B淋巴細(xì)胞的參與體液免疫的IL-4、IL-6和IL-10等細(xì)胞因子來抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，并使巨噬細(xì)胞失活，不利于疾病治愈；另外，Th17細(xì)胞的重要執(zhí)行細(xì)胞CD4+T淋巴細(xì)胞可分泌具有強大促炎作用的IL-17、IL-21、腫瘤壞死因子α和IL-22等促炎性因子，促使間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子，趨化白細(xì)胞到病灶集中、成熟、活化，而活化的白細(xì)胞釋放溶酶體酶等物質(zhì)加重炎癥反應(yīng)[17]。在結(jié)核感染初期，CD4+T淋巴細(xì)胞因參與早期抗結(jié)核反應(yīng)而升高；至疾病后期，CD4+T淋巴細(xì)胞下降，可能與機體反向調(diào)節(jié)及T淋巴細(xì)胞功能耗竭有關(guān)[18-20]。本研究中肺結(jié)核與結(jié)核性腦膜炎患者的T淋巴細(xì)胞計數(shù)均具有以上變化規(guī)律，但后者細(xì)胞降低更多，提示后者免疫水平受損更為嚴(yán)重。

綜上所述，通過對5組患者T淋巴細(xì)胞計數(shù)情況的研究，可以初步判斷T淋巴細(xì)胞計數(shù)在不同患者中的變化情況，總T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞計數(shù)以對照組最高，其次為NTM組，3組結(jié)核病患者最低，認(rèn)為應(yīng)用流式細(xì)胞儀進行T淋巴細(xì)胞計數(shù)的檢測可輔助臨床診斷NTM病。