王燕新，廖圓圓，郭曉農,2，蔡德育

( 1．西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030;2.蘭州大學 草地農業(yè)科技學院,草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室,甘肅 蘭州 730030)

枇杷葉(EriobotryajaponicaThunb)為雙子葉植物，又名蘆桔葉、杷葉，是我國中草藥中的一種藥材[1-2].枇杷葉做成的膏狀物，具止咳祛痰、祛熱潤肺的功能，而蒸制枇杷葉取露，可以解暑.近幾年，一些實驗報道了枇杷葉內有許多已經了解的成分，如皂苷、黃酮類、多糖等物質[3-5].目前對枇杷的研究主要集中在止咳祛痰、抗炎消腫、抗腫瘤等方面，而對于其所含多糖的相關報道較少.有研究表明，多糖可以提高人體免疫力[6]，能夠抗腫瘤[7]、抗衰老[8]、抑菌[9].多糖類化合物在生物學各方面都有較高的利用價值和開發(fā)潛力.從植物葉片中提取得到的多糖類化合物，已成為全世界關注的熱門課題，但還缺乏對多糖成分和藥理的深入探究.因此本實驗選取枇杷葉作為實驗材料，研究其多糖的抗氧化活性.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

95%乙醇，氯仿，無水乙醇，丙酮，正丁烷，三氯甲烷，6.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液，6.0 mmol/L水楊酸，50.0 mmol/LTris-HCl緩沖液，5.0 mmol/L鄰苯三酚溶液，0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH6.6)，1%鐵氰化鉀溶液，0.1%三氯化鐵，不同濃度的過氧化氫溶液，15%三氯乙酸，0.67%硫代巴比妥酸.試驗試劑均為國產分析純.

1.2 儀器與設備

加熱套，球形燒瓶，冷凝管，旋轉蒸發(fā)儀，坩堝，水浴鍋，離心機，分光光度計，電子天平等.

1.3 方法

1.3.1 枇杷葉的預處理

枇杷葉除去塵土和葉背部毛絮，蒸餾水潤洗放入托盤并用60 ℃的烘箱烘烤24 h，粉碎備用.

1.3.2 枇杷葉多糖的粗提

稱取50 g枇杷葉原材料粉末，按照料液質量體積比1∶20加入蒸餾水，回流法提取三次，每次2.5 h，合并提取液.旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)合并的提取液，得到濃縮液500 mL，90 ℃水浴鍋中水浴2 h至葉綠素完全析出.濾除葉綠素沉淀后加3倍體積95%乙醇靜置48 h進行醇沉(醇沉3次)，使多糖完全沉淀，所得溶液為多糖粗提取物.

1.3.3 枇杷葉多糖的精提

用濾紙過濾上述所得溶液，得到浸膏.將浸膏轉入坩堝，沸水浴加熱濃縮，即得粗多糖干品，稱重，計算得率.將得到的羅布麻粗多糖干品用蒸餾水溶解，通過SevAge法除去蛋白， 再加入3倍體積95%的乙醇，使乙醇最終體積為80%，4 ℃靜置24 h.離心后將沉淀備用， 并用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮以及乙醚分別對得到的沉淀進行清洗，最后在60 ℃下烘干，即可得到枇杷葉多糖[10].

1.3.4 枇杷葉多糖含量測定1.3.4.1 多糖標準曲線的制備

參照李瑞燕[11]研究方法進行多糖標準曲線的繪制.

1.3.4.2 提取物中多糖含量的測定

準確稱取干燥的枇杷葉多糖的粉末約2 mg，配制成0.2、 0.4、 0.6、0.8、 1.0、1.2 mg/mL的溶液,測定樣品吸光度值即可反映樣品的多糖含量.

1.4 枇杷葉多糖體外抗氧化能力的研究

本實驗通過枇杷葉多糖對羥自由基清除作用、超氧自由基的清除作用、還原作用，以及用分光光度法對DPPH自由基清除作用來探究枇杷葉多糖的抗氧化活性作用的強弱，并用維生素C(Vc)作為陽性對照.

1.4.1 樣品溶液制備

將枇杷葉多糖先配制成2 mg/mL的起始濃度備用，再將樣品及標品Vc依次配成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，保鮮膜封口待用，并用標準Vc做陽性對照.

1.4.2 對羥自由基的清除作用[12-13]

取10 mL具塞試管，按順序加入6 mmol/L FeSO42 mL，6 mmol/L水楊酸2 mL，不同濃度的樣品溶液2 mL，最后加6 mmol/LH2O22 mL進行啟動反應，37 ℃下反應1 h，在510 nm下測量各濃度的吸光度.以蒸餾水替換樣品形成一個空白對照組.以濃度為6 mmol/L的 FeSO4、濃度為6 mmol/L的水楊酸和蒸餾水各2 mL混合形成樣品的本底吸收(即不加H2O2).計算羥自由基清除率.

清除率(%) =[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%

上式中的A0為空白對照組的A值，Ax為加入樣品后的A值，Ax0為樣品本底的A值.

1.4.3 對超氧陰離子自由基的清除作用[14]

取10 mL具塞試管，分別加入50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2，含2 mmol/LEDTA-2NA)4.5 mL、5.0 mmol/L鄰苯三酚溶液(以10 mmol/L鹽酸配制)0.2 mL.之后添加上述的枇杷葉多糖樣品1.0 mL，蒸餾水2.5 mL，將其混勻.以體積相等的10 mmol/L的鹽酸替換鄰苯三酚為空白調零，用相等的去離子水取代樣品作為對照組.于25 ℃下放置20 min，在波長為325 nm下檢測樣品和對照管的A值，每次檢測相隔30 s，計算A值(吸光度)在線性范圍內跟時間的改變值的關系，多次測量并計算，此步驟操作3次.以Vc陽性作對照組，同種方法也進行3次平行試驗，取平均值.然后計算超氧陰離子自由基的清除率.

清除率=(V1-V2)/V1×100%

上式中V1為對照組鄰苯三酚的自氧化速率△A/min；V2為樣品，管鄰苯三酚的自氧化速率△A/min.

1.4.4 還原能力的測定[15]

依次取各樣品溶液2 mL，吸取0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)2 mL后加入1%鐵氰化鉀2 mL，搖勻后在50 ℃水浴鍋中放置20 min，使其充分反應.從水浴鍋中拿出后充分混勻加入2 mL的10%三氯乙酸.再用移液槍吸取2 mL的混合溶液，加上2 mL蒸餾水和0.4 mL 的0.1%的三氯化鐵于反應管中，反應10 min后，于700 nm波長處測定A值.以Vc作陽性對照，用上述同種方法重復操作.

1.4.5 對DPPH自由基的清除作用

量取2 mL的DPPH溶液，加入2 mL的95%的乙醇，完全混合均勻后測519 nm處的A值.此時的A值為A0.

量取2 mL的DPPH溶液，加入樣品溶液2 mL，完全混勻，靜置30分鐘后，測519 nm處的A值.

清除率=(A0-A)/A0×100%

2 結果與分析

2.1 對羥自由基的清除作用

羥自由基是毒害極強、風險極高的一類活性氧物質.羥自由基可以消滅紅細胞，降解DNA及細胞膜、多糖等物質.大部分由羥自由基所導致的不良后果會因加入羥自由基清除劑后大幅度改善.羥自由基的清除率是評判相關藥品抗氧化能力不可或缺的依據.探討羥自由基的清除劑對探究和揭示一些發(fā)病原因、致病機理、衰老原理是不可小覷的.在羥自由基清除的反應中，H2O2和鐵離子二價狀態(tài)時接觸后會發(fā)生芬頓反應，并且可以產生羥自由基，且其活性很高.這個自由基能與水楊酸有效結合，會得到有顏色的化合物.但在這個體系中可添加某些作為清除劑的化合物.這個物質就會與水楊酸發(fā)生競爭反應且為良性的，可以降低合成有顏色物質的量.因此，可利用吸光值的變動來評價枇杷葉多糖對羥自由基的清除效力[16].

圖1葡萄糖標準曲線 圖2對羥自由基的清除作用

由圖2可知，隨著枇杷葉多糖質量濃度的增加，其對羥自由基的清除也隨之加強，同時對照組Vc的清除能力也伴著其質量濃度的加大而增強.最后根據分析得出，在0.2～1.2 mg/mL的質量濃度時，枇杷葉多糖和Vc的變化程度與自由基清除作用都呈弱線性相關.由圖中結果可以看出,對羥自由基的清除能力Vc好于枇杷葉多糖.

2.2 對超氧陰離子自由基的清除作用

超氧陰離子是全部自由基的前身，在生物體內的反應中進行氧化還原反應，有2%～5%的氧可能會生成超氧陰離子自由基，且有毒，它的毒作用會導致氧中毒反應.在堿性環(huán)境下鄰苯三酚能夠自氧化并且產生中間產物，然而它卻能促使鄰苯三酚的自氧化，在實驗下可以測得物質對鄰苯三酚自氧化的阻礙作用，從而可以表現(xiàn)其對超氧自由基的清除能力.

由圖3顯示，由于枇杷葉多糖和Vc溶液質量濃度的加大，枇杷葉多糖對超氧自由基的清除率呈顯著遞增作用，維生素C的清除率也呈上升趨勢.從圖3可以得出結論：枇杷葉多糖和Vc的變化趨勢與自由基清除能力呈線性相關關系，而且Vc的線性相關關系略好于枇杷葉多糖.

2.3 還原能力的測定

反應的還原效果可以用抗氧化劑的抗氧化效果反映出來.它的機理是添加物將鐵氰化鉀變成了亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀再與三價鐵反應，生成一種物質叫做普魯士藍,并在700 nm處測它的A值(吸光度),以此來評估還原力的強弱：A值(吸光值)越高，則顯示所加物的還原能力越強.

圖3對超氧陰離子自由基的清除作用 圖4還原能力的測定

由圖4顯示，隨著質量濃度的加大，枇杷葉多糖和Vc的吸光度值也增大，即其還原的能力也在呈增強趨勢.從圖4可以得出結論：枇杷葉多糖的還原能力與質量濃度呈線性相關，而且強于Vc的線性相關關系.

2.4 對DPPH自由基的清除作用

DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基，由于其分子中存在數個吸引電子的-NO2和苯環(huán)的大π鍵，故氮自由基可以保持穩(wěn)定.當清除掉體系中的DPPH自由基時，其在519 nm處的A值就會下降.DPPH作為穩(wěn)定的自由基，可用來檢測清除自由基活性的情況，能夠提供理想而簡單的藥理模型.

由圖5結果可知，枇杷葉多糖對DPPH自由基的清除率在質量濃度為0.2～1.2 mg/mL時，隨著枇杷葉多糖溶液濃度和Vc溶液濃度的增加，其清除率逐漸增加，呈現(xiàn)弱線性關系.可見枇杷葉多糖和Vc對DPPH自由基表現(xiàn)出較好的清除效果，而且Vc溶液對DPPH的清除率在1.0 mg/mL處達到99.5%.枇杷葉多糖對DPPH自由基清除能力略弱于Vc溶液.

圖5 對DPPH自由基的清除作用

2.5 討論

本次實驗以Vc為對照組，從四個方面對枇杷葉多糖的抗氧化能力進行評價，從所得結論的折線圖可以看出枇杷葉多糖都有著較為顯著的抗氧化活性，而且枇杷葉多糖的濃度越大，效果越明顯.變化程度與羥自由基清除效果，超氧陰離子的清除效果，還原能力以及對 DPPH自由基的清除能力都呈線性相關.在還原能力的測定中表現(xiàn)出枇杷葉多糖高于Vc，但是對超氧陰離子、羥自由基和DPPH自由基的清除能力均表現(xiàn)為枇杷葉多糖略低于Vc.通過實驗得到的數據做出折線圖后分析得到：枇杷葉多糖是一種含一定的抗氧化能力物質，而且其抗氧化的作用呈弱線性關系.Vc是一種具有較強抗氧化能力的抗氧化劑，可以作為自由基清除劑.

3 結論

通過水提法所得枇杷葉多糖提取率為6.43%.其體外抗氧化活性的研究表明，羥自由基的清除率、超氧陰離子自由基清除率以及DPPH的自由基的清除率均隨枇杷葉多糖濃度的增加而增加，最高清除率分別為59.4%、62%、73.9%，說明枇杷葉多糖具有良好的抗氧化活性，有較強的自由基清除能力，還具有一定的抗氧化能力.