林晟豪,杜再慧,張秀杰,黃昆侖,3,劉清亮,許文濤,3*

1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京 100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心,北京 100122；3.中國農(nóng)業(yè)大學,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(食用)重點實驗室,北京 100083；4.山東拜爾檢測股份有限公司,山東 濰坊 261061

目前，核酸擴增技術在分子生物學研究領域中發(fā)揮著重要作用，具體可分為變溫擴增技術和等溫擴增技術。變溫擴增技術主要為PCR；等溫擴增技術則包括滾環(huán)擴增(rolling cycling amplification，RCA)、指數(shù)擴增反應(exponential amplification reaction，EXPAR)、鏈置換擴增(strand displacement amplification，SDA)、依賴解旋酶等溫擴增(helicase-dependent isothermal amplification，HDA)以及環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等。變溫擴增技術對設備依賴性強，因此適用場合受到了一定的限制；而與之相比，等溫擴增技術只需在恒定溫度下即可完成，易于實現(xiàn)原位和實時檢測。

等溫擴增技術中的HDA技術易受DNA解旋酶和靶DNA長度的影響，SDA技術和EXPAR技術受到限制性核酸內(nèi)切酶的限制，均難以在基因工程中推廣；RCA技術則因需要昂貴的鎖式探針而受到限制，并且存在信號檢測背景。而于2000年被日本榮研化學株式會的Notomi等[1]發(fā)現(xiàn)的LAMP技術，通過設計4～6種特異性引物識別靶標DNA的6～8個區(qū)域，在65 ℃左右的恒溫條件下由DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)聚合延伸，從而可實現(xiàn)靶標DNA的109～1010倍擴增。相較于HDA、SDA、EXPAR和RCA等其他等溫擴增技術，LAMP沒有被上述因素所局限，是目前研究最多、最成熟的一種等溫擴增技術，具有簡單、快速、特異性強等優(yōu)點[2]。生物傳感器是以生物學組件作為主要功能性元件，能夠感受規(guī)定的被測量物質(zhì)并按照一定規(guī)律將其轉(zhuǎn)換成可識別信號的器件或裝置。根據(jù)生物傳感器的輸出信號可分為比色生物傳感器、熒光生物傳感器、電化學生物傳感器以及其他種類的生物傳感器。目前，基于LAMP技術的生物傳感器各具特色，被廣泛開發(fā)利用?；诖?，本文對LAMP進行了基本介紹，然后，重點介紹了基于LAMP的各類生物傳感器，并對各類生物傳感器的特點進行了總結(jié)、比較。最后，剖析了LAMP生物傳感器目前的不足，并對其未來的發(fā)展方向做出展望，以期為今后研發(fā)低成本、高靈敏度、自動化、微型化的LAMP生物傳感器提供參考。

1 環(huán)介導等溫擴增技術

LAMP技術是一種等溫擴增技術，其反應體系主要由模板、4～6種特異性引物、dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+、甜菜堿(betaine)等組成。其中，特異性引物的設計是LAMP技術的關鍵，根據(jù)模板鏈的3′端的F3c區(qū)段、F2c區(qū)段、F1c區(qū)段和5′端的B3區(qū)段、B2區(qū)段、B1區(qū)段設計LAMP引物，具體位置如圖1所示。為了達到良好的擴增效果，引物設計還要遵循一定的設計原則[4]，具體為：F2的5′到B2的5′為120～180 bp，F(xiàn)3的3′到F2的5′為0～20 bp，F(xiàn)2的5′到F1的5′為40～60 bp；F1c/B1c的Tm值在64～66 ℃，F(xiàn)2/B2的Tm值在59～61 ℃，F(xiàn)3/B3的Tm值在59～61 ℃；F2/B2、F3/B3的3′端和F1c/B1c的5′端的脫氧鳥嘌呤核苷(deoxyguanosine，dG)小于-16.72 kJ/mol；GC含量的范圍為40%～65%。同時，還可通過日本榮巖株式會社環(huán)介導引物設計軟件Primer Explorer 4.0(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)來完成引物設計。此外，LAMP擴增體系中加入甜菜堿可以減少二級結(jié)構(gòu)的形成，更利于LAMP反應的進行。

圖1 LAMP引物設計[3]Fig.1 Primer design of LAMP[3]

LAMP通常在65 ℃左右進行，主要是由于基因組在65 ℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當DNA序列與引物配對后即可進行互補延伸，延伸的過程即可將基因組剝離得到另外一條單鏈[5-6]，進而完成LAMP循環(huán)擴增。與其他擴增方法相比，LAMP方法具有以下幾個優(yōu)點。①擴增條件簡單，不需要進行雙鏈的變性，在恒定溫度下即可完成擴增[7]。②設計4～6條引物靶向6～8個區(qū)段，特異性較高[8]。③1 h內(nèi)即可實現(xiàn)靶標DNA 109～1010倍的擴增，如果在LAMP反應中加環(huán)引物，反應速度還可提高1/2～1/3[4]。④靈敏度高，檢測限可達10個拷貝甚至更少[9]。⑤檢測信號多樣、簡單，如電泳分析、焦磷酸鎂濁度分析[10]、比色指示劑顏色變化、熒光信號輸出等。⑥在體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，可實現(xiàn)RNA的LAMP擴增[11]。但LAMP同時還具有以下幾個缺點。①引物設計具有一定的難度，易導致非特異性擴增，造成假陽性[12-13]。②反應靈敏度高，當空氣中存在氣溶膠污染時極易造成污染[14-15]。③擴增產(chǎn)物復雜多樣，導致目標DNA片段難于分離，難以進行下一步的序列分析。④擴增長度需要控制在300 bp以內(nèi)，大于500 bp則難以擴增。

2 LAMP比色生物傳感器

2.1 基于比色指示劑的LAMP生物傳感器

2.1.1金屬變色指示劑 常見的金屬變色指示劑有羥基萘酚藍(hydroxynaphthol blue，HNB)[16]和孔雀綠[17]，其中使用和研究最多的是HNB。HNB與Mg2+結(jié)合顯示紫羅蘭色；當LAMP反應時，Mg2+與焦磷酸根結(jié)合生成沉淀，HNB失去Mg2+轉(zhuǎn)變?yōu)樘焖{色，變色現(xiàn)象肉眼可見[18]。如以HNB作為指示劑，檢測到了30 CFU/mL的大腸桿菌[16]。

2.1.2金納米粒子 ①金納米球。在高鹽條件下，金納米球(gold nanoparticles，AuNPs)單獨存在時會發(fā)生鹽聚而顯示藍色，同時紫外(ultraviolet，UV)光譜從520 nm向更長波移動。在AuNPs上修飾具有靶DNA互補序列的寡合探針，當LAMP擴增后，LAMP擴增子與AuNPs探針互補雜交，從而阻止AuNPs聚集而顯紅色，該現(xiàn)象可以直接通過肉眼觀察，或者通過檢測UV光譜在520 nm處是否發(fā)生紅移，從而實現(xiàn)定量檢測。利用該原理，Suebsing等[19]針對白斑綜合征蝦中微孢子蟲腸球菌核糖體小亞基RNA(small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)基因進行檢測，結(jié)果表明檢出限達到0.02 fg，靈敏度是普通PCR的10倍。

此外，在AuNPs表面修飾特定基團后，其可與焦磷酸鎂發(fā)生螯合，從而出現(xiàn)顯色或沉淀。如當11-巰基十一烷酸(11-mercaptoundecanoic acid，MUA)修飾在AuNPs上時，MUA-AuNPs可以螯合Mg2+，其在低Mg2+下游離并顯示紅色，在高Mg2+下螯合Mg2+并顯示紫色[20]。在LAMP反應中Mg2+濃度逐漸降低，加入MUA-AuNPs后，溶液顏色會發(fā)生從紫色到紅色的變化。Wong等[20]使用該方法檢測λDNA的特定模板，得到了200個拷貝的檢測限。在加入MUA-AuNPs的同時，加入乙二醇(ethylene glycol，PEG)修飾的AuNPs，可以螯合Mg2+使AuNPs聚集顯示紅色。這是由于LAMP反應體系中會生成大量焦磷酸鎂，與MUA/PEG-AuNPs結(jié)合生成紅色沉淀，該現(xiàn)象可以直接通過肉眼觀察，或者通過檢測UV光譜在520 nm處是否發(fā)生紅移，從而實現(xiàn)定量檢測，檢測限可以低至500個拷貝[21]。

②金納米棒。金納米棒(gold nanorods，GNRs)與AuNPs不同，GNRs因其細長形狀而具有一些獨特的表面電荷和光學性質(zhì)。十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)可以組裝在GNRs表面，使GNRs表面帶有大量正電荷。在LAMP反應時，帶負電荷的靶DNA與修飾后的GNRs相互吸引，顏色從紅色轉(zhuǎn)為紫色，該現(xiàn)象可以直接通過肉眼觀察，或者使用紫外可見分光光度計(UV-vis)分析加入GNRs前后溶液在915 nm處的峰值是否下降以及在可見峰525 nm處的峰值是否紅移，從而實現(xiàn)定量分析。該方法可用于檢測人類流感病毒，靈敏度較高，檢測限低至1 pg[22]。

2.1.3G-四聯(lián)體 G-四聯(lián)體(G-quadruplex)是由4個環(huán)狀氫鍵和鳥嘌呤(G)組裝成的2個或者多個G-四分體形成的π堆積結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由于暴露了G-四分體的表面，所以可以結(jié)合眾多類似G-四分體的配體，如帶有卟啉結(jié)構(gòu)的配體[23-24]。當LAMP擴增子中有富G序列時，在存在單價陽離子(如Na+或K+)的情況下可折疊成G-四聯(lián)體構(gòu)型，該構(gòu)型與插入的氯高鐵血紅素結(jié)合將具有特定的催化活性，可將無色的2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基-苯并噻唑琳-6-磺酸)二胺鹽[2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt，ABTS2-]氧化成綠色的ABTS-，該現(xiàn)象可以直接通過肉眼定性判別，或者借助吸收光譜進行定量分析[25]。Zhu等[26]利用該方法，在上游內(nèi)引物(forward inner primer，F(xiàn)IP)上簡單修飾了17 nt富含C的寡核苷酸，檢測到了0.5 pg甚至更少的沙門氏菌invA基因。

2.1.4焦磷酸鎂 LAMP反應進行時，焦磷酸根離子會大量合成并與Mg2+結(jié)合產(chǎn)生肉眼可見的焦磷酸鎂白色沉淀，而PCR法擴增產(chǎn)生的焦磷酸離子只有不到0.1 μmol/L。研究表明，通過肉眼觀察白色沉淀，可檢測到6×104CFU/mL的青枯雷爾氏菌[10]。而Mori等[27]進一步證明了靶DNA的擴增量與濁度變化具有線性關系，焦磷酸鎂沉淀在400 nm處的吸收光度與反應體系的濁度也存在相關性，所以根據(jù)400 nm處吸光度計算溶液濁度，再換算到靶DNA的擴增產(chǎn)物總量，即可定量分析LAMP反應的擴增效率。如Kouzaki等[28]使用濁度計檢測到了1.0 pg的?？ń槊鏜基因，遠高于肉眼檢測的靈敏度。

2.1.5氫氧化銅 在LAMP反應中，有待測基因組存在時，只會生成少量Mg2P2O7沉淀，而對照組(未加待測基因組)中dNTPs的含量不變，dNTPs解離出的OH-，可以與加入的CuSO4生成Cu(OH)2環(huán)狀白色沉淀，該沉淀比Mg2P2O7沉淀更易觀察[29]。Kanchanaphum等[29]通過該方法檢測人的載脂蛋白L1基因(ApoL1)，得到了10 pg的檢測限。

2.1.6pH指示劑 在最小緩沖條件下，LAMP反應產(chǎn)生的H+會顯著降低溶液pH，使用特定的pH指示劑檢測pH變化即可實現(xiàn)視覺上檢測靶DNA擴增與否。目前，已經(jīng)開發(fā)的pH指示劑多用二甲酚橙(xylenol orange，XO)，其隨著pH的降低，顏色從紫色變成紅色/橙色。該方法成本低廉、操作簡單，并且不會抑制DNA聚合酶的活性[30]，但是理論上說pH降低2個單位以上才適合使用pH敏感指示劑[31]。研究表明，利用該方法檢測大腸桿菌時能夠檢測到1 CFU大腸桿菌[32]。

2.2 基于免疫吸附的LAMP生物傳感器

2.2.1酶聯(lián)免疫吸附 酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)主要有3種分類：直接ELASA、間接ELASA和夾心ELASA。使用ELISA測定時，待測物與固相載體表面的抗原/抗體發(fā)生反應，洗滌分離抗原/抗體復合體，再加入酶標記的抗原/抗體將其固定在固相載體上。由于產(chǎn)物的量和顏色深淺與原物質(zhì)的量直接相關，因此可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。LAMP與ELISA結(jié)合起來的LAMP-ELISA法具有高度靈活性和高通量等優(yōu)點，不需要昂貴的設備[33-34]，并且檢測靈敏度高，用于檢測犬細小病毒時，檢測限低至25個拷貝[35]。

2.2.2側(cè)向流層析試紙條 側(cè)向流層析試紙條(lateral flow dipstick，LFD)依賴于試紙條上的抗原/抗體或配體相互作用，通過觀察紙條上的檢測線和質(zhì)控線即可判斷靶DNA擴增與否。標記X2的探針與標記X1的擴增子雜交，并與標記X2抗體的膠體金結(jié)合形成三元復合物，通過橫向?qū)游鼋Y(jié)合到標記X1抗體的檢測線上并呈現(xiàn)紅色；而未雜交的標記X2的探針與標記X2抗體的膠體金穿過檢測線后結(jié)合在質(zhì)控線上。通過觀察條帶就可以判斷有無LAMP擴增產(chǎn)物產(chǎn)生。Pasookhush等[36]通過雙重LAMP(duplex LAMP，dLAMP)結(jié)合LFD檢測創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌，其中創(chuàng)傷弧菌的檢測限達到2.2×104CFU/mL，與雙重PCR(duplex PCR，dPCR)的檢測靈敏度一致；而副溶血弧菌的檢測限達到2.2×103CFU/mL，比dPCR的靈敏度高100倍。

2.2.3免疫磁珠 磁珠(magnetic beads，MBs)可以在磁場下聚集，并在移除磁體的時候分散[37]。磁珠分離法具有處理簡單、快速、高效、減少產(chǎn)物損失和清潔等優(yōu)點[38-41]。Roy等[42]在MB和LAMP引物上分別修飾鏈霉親和素、生物素，當LAMP反應時，生物素化的靶DNA與修飾鏈霉親和素的磁珠結(jié)合形成聚合物，在外磁場的作用下分離聚合物并移到紙上，可以通過肉眼觀察到紅色的斑點，同時，拍照后利用Image J軟件分析，定量檢測到了1 pg/μL的沙門氏菌。

2.3 其他LAMP比色生物傳感器

咖啡環(huán)效應在生活中較為常見，產(chǎn)生的原因如下：三相接觸線的較高蒸發(fā)速率引起毛細管流動，溶液被運輸?shù)揭后w的周邊，當溶劑被蒸干之后，懸浮的焦磷酸鎂顆粒被集中固定在邊緣，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)[43]。近年來，研究還發(fā)現(xiàn)咖啡環(huán)的寬度與LAMP反應前的DNA濃度呈對數(shù)線性關系，因此該方法還可以用于定量分析[44-45]。Zhang等[46]以SiO2納米粒子的膠體晶體材料為基質(zhì)，利用咖啡環(huán)效應得到了肉眼可見的環(huán)狀物質(zhì)，并結(jié)合智能手機檢測沙門氏菌反應體系，在5 min內(nèi)得到了20個拷貝的檢測限。

此外，雖然紙張分析裝置的比色分析所需設備簡單，具有簡單快速、低成本等特點，可用于資源匱乏的地區(qū)，但是因為人為差異可能導致測量結(jié)果不穩(wěn)定[47-48]。研究表明，HNB可以與Mg2+結(jié)合顯示紫色，并且當Mg2+濃度降低時，顏色從紫色變?yōu)樘焖{色[18]。因此，在紙張上固定可以與HNB結(jié)合的一種強陽離子聚合物(如聚乙烯亞胺)，將LAMP反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到紙張上，溶液因為毛細管效應在紙張上遷移，遷移過程中游離的HNB與聚乙烯亞胺結(jié)合并被固定在紙張上，使用洗滌劑洗脫HNB-Mg2+后紙張上將留下藍色條帶。LAMP擴增子的量與游離HNB存在一定關系，而游離HNB的量與藍色條帶的距離成比例，因而可以使用該方法半定量檢測LAMP反應[49]。Hongwarittorrn等[49]利用該方法檢測大腸桿菌的malB基因，在5 min內(nèi)得到了4.14×103個拷貝的檢測限。

3 LAMP熒光生物傳感器

3.1 基于金屬變色指示劑的LAMP生物傳感器

常見的金屬變色指示劑為鈣黃綠素(calcein)[50]。在LAMP反應前，鈣黃綠素與錳離子結(jié)合，淬滅熒光顯橙色；當LAMP反應時，錳離子被釋放并與焦磷酸根結(jié)合產(chǎn)生焦磷酸錳沉淀，鈣黃綠素與殘留的鎂離子結(jié)合，恢復至綠色熒光[51]。如以鈣黃綠素作為指示劑，檢測到了2.2×102CFU的黃桿菌[50]。

3.2 基于熒光指示劑的LAMP生物傳感器

常見的熒光指示劑有SYBR Green Ⅰ[52]、EvaGreen[53]、溴化乙錠[54]、碘化丙啶[55]、PicoGreen[56]、SYTO-81和SYTO-9[57]、隱色三苯甲烷[58]等。SYBR Green Ⅰ本身具有可忽略的熒光，但是嵌入到靶DNA的小溝中，熒光會增強數(shù)千倍，同時顏色從橙色變?yōu)榫G色[59-61]，該變化在紫外下肉眼可見。Chen等[52]利用該方法檢測豬肉中的金黃色葡萄球菌，得到了50 CFU/mL的檢測限。在LAMP體系中加入SYBR Green Ⅰ，并使用實時定量PCR儀檢測體系中的熒光變化，即可實現(xiàn)實時熒光檢測。如Seyrig等[9]在LAMP體系中加入SYBR Green Ⅰ，并使用實時定量PCR儀檢測體系中的熒光變化，能夠檢測到10個拷貝的青枯雷爾氏菌基因。

含特定序列的LAMP擴增子在特定條件下折疊成G-四聯(lián)體并結(jié)合氯高鐵血紅素后，除了使用比色生物傳感器檢測信號，還可以向體系中加入魯米諾(luminol)等熒光指示劑激發(fā)熒光，通過檢測420 nm處的吸收峰監(jiān)控LAMP反應，如Xu等[62]利用該方法檢測到了50 CFU/mL的金黃色葡萄球菌。

各類比色指示劑的變色情況有一定差異，為了方便選擇用于檢測LAMP產(chǎn)物的比色指示劑，總結(jié)了部分典型熒光指示劑反應前后的顏色變化與對反應的抑制作用，具體見表1。

表1 各種熒光指示劑的比較Table 1 Comparison of various fluorescent indicators

3.3 基于熒光基團的LAMP生物傳感器

在FIP和與FIP互補的F1c探針上分別修飾熒光基團和淬滅基團，將兩者退火雜交。隨著LAMP反應的進行，探針剝落下來，反應體系發(fā)出熒光，Tanner等[64]使用該方法檢測噬菌體HeLa基因組，得到了10 pg的檢測限。同時，該方法還可以通過修飾多種不同的熒光基團和淬滅基團，從而實現(xiàn)多重LAMP檢測。

3.4 其他LAMP熒光生物傳感器

生物發(fā)光的原理是LAMP反應時釋放的焦磷酸根離子在腺苷三磷酸硫酸化酶(ATP sulphurylase)催化下與硫酸銨(ammonium persulfate，APS)反應形成ATP，ATP、底物熒光素(luciferin)和O2又在熒光素酶(luciferase)的催化下生成一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)、焦磷酸根離子、CO2和光。Kiddle等[65]利用該原理檢測轉(zhuǎn)基因玉米中的CaMV35S啟動子和NOS-t終止子，能夠測定0.1%污染水平的轉(zhuǎn)基因玉米。

4 LAMP電化學生物傳感器

4.1 基于電化學活性物質(zhì)的LAMP生物傳感器

利用電化學方法檢測具有快速、成本低、操作簡單、更易小型化等優(yōu)點，基于電化學活性物質(zhì)與靶標DNA結(jié)合會引起測量電流變化的原理，按照電化學活性物質(zhì)與靶DNA結(jié)合特點的不同可分為結(jié)合探針和嵌合劑2種類型[66]。①使用結(jié)合探針：在基底上修飾特異性靶向靶標DNA的寡核苷酸探針，LAMP反應中隨著靶DNA濃度的增大，探針不斷捕獲靶DNA并產(chǎn)生電信號變化。②使用嵌合劑：LAMP反應中隨著靶DNA濃度的增大，靶DNA與嵌合劑結(jié)合增加并產(chǎn)生電信號變化。關于電信號的檢測，通常使用線性掃描伏安法(linear sweep voltammetry，LSV)[67]、方波伏安法(square wave voltammetry，SWV)[68-69]、差分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry，DPV)[70-71]、循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry，CV)等。

根據(jù)電化學傳感器能否及時檢測，可以分為終點檢測與實時檢測。①終點檢測。以結(jié)合探針Hoechst 33258為例，在溶液中Hoechst 33258與靶DNA小溝結(jié)合可導致電極表面電子大量還原，電流響應顯著下降。Safavieh等[67]采用Hoechst 33258定量檢測大腸桿菌，在1 h內(nèi)得到了24 CFU/mL的檢測限。②實時檢測。以嵌合劑亞甲基藍(methylene blue，MB)為例，MB遇到電極會轉(zhuǎn)移電子并產(chǎn)生電流。LAMP反應開始，MB嵌入靶DNA中，引起自由的MB濃度變化，從而引起氧化電流變化[72-73]。Hsieh等[72]使用MB作為指標，檢測到了16個拷貝(4 fg/mL)的沙門氏菌invA基因。

4.2 基于非電化學活性物質(zhì)的LAMP生物傳感器

LAMP反應中產(chǎn)生的焦磷酸根離子可以在焦磷酸酶的作用下水解成磷酸根，磷酸根可以和特定的金屬鹽反應生成具有氧化還原介體性質(zhì)的沉淀物沉積在電極表面，進而引起電化學信號的變化，該方法可以用于實時檢測。Xie等[3]在LAMP反應體系中加入酸性鉬酸鹽，利用循環(huán)伏安法測定電信號，檢測到了17 fg/μL家蠶微孢子蟲病的病原體的PTP1基因組。

LAMP反應時，pH的變化與擴增產(chǎn)率之間存在強烈的相關性，所以可以通過檢測H+來監(jiān)測LAMP反應[74]。針對H+的檢測方法可以分為直接法和間接法。①直接法。可使用pH計直接測量溶液的H+變化[15]。此外，還可利用場效應原理開發(fā)的離子敏感場效應傳感器進行檢測，只是此類傳感器依賴于流體柵極電位的建立，需要對參考電極進行復雜的微加工[75]。如Veigas等[76]設計了Ta2O5離子場效應傳感器用于檢測人類c-myc原癌基因，得到了108～1011個拷貝的檢測范圍。②間接法。通過pH計檢測LAMP反應中的H+變化雖然便攜、快速，但是靈敏度較低。通過H+對特定靶DNA復合物的作用，聯(lián)級放大電化學信號，從而可以較大程度的提高靈敏度。Zhao等[77]開發(fā)了一種新型電化學傳感器間接檢測H+，首先將二茂鐵探針(Fe-Sp)和Au-Fe3O4修飾的具有特定序列的DNA(Ts)在pH 8.0的條件下雜交，在外磁場的作用下分離之后得到pH依賴型的復合探針(DNA NSs)。在H+的作用下，DNA NSs中二茂鐵探針發(fā)生構(gòu)象變化并被釋放，剩下的結(jié)構(gòu)將在H+的作用下折疊成穩(wěn)定的DNA三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。針對二茂鐵探針設計捕獲探針并修飾在電極表面，讀取電化學信號的變化，可以間接檢測到0.31 fg/μL的蠶微粒子蟲的PTP1基因。

5 其他LAMP生物傳感器

5.1 表面等離子共振生物傳感器

表面等離子共振(surface plasmon resonance，SRP)是一種光學現(xiàn)象，當一入射波射入金屬中，金屬表面極化并產(chǎn)生金屬表面等離子波(surface plasmon waves，SPW)，當入射波沿界面方向的波矢分量和SPW的波矢相同時就會發(fā)生表面離子共振，使反射波能量被SPW吸收而急劇下降，從而在反射光譜上形成明顯的吸收峰[78-79]。SPR吸收的光的波長與金屬表面接觸的介電膜的折射率直接相關，所以SPR生物傳感器測定的主要參數(shù)是溶液折射率的變化。①需修飾的SPR生物傳感器。在傳感器表面固定鏈霉親和素，并設計修飾有生物素的引物。LAMP反應過程中生成大量生物素化的LAMP擴增子結(jié)合到傳感器上，引起傳感器表面折射率發(fā)生變化，利用SPR生物傳感器測量溶液的折射率變化即可直接監(jiān)測LAMP反應。Kawin等[80]利用該方法檢測耐甲氧林金黃色葡萄球菌的femB和mec片段，得到了10個拷貝/μL的檢測限。②無需修飾的SPR生物傳感器。LAMP反應過程中LAMP產(chǎn)物與Mg2P2O7的濃度變化會引起溶液的折射率變化，Chuang等[81]利用此原理測量溶液的折射率變化，直接檢測到了2 fg/mL的乙肝病毒。

5.2 巨磁阻生物傳感器

巨磁阻(giant magneto resistive，GMR)效應基于量子力學磁阻效應，在由交替的鐵磁和非磁導電層組成的薄膜結(jié)構(gòu)中可以產(chǎn)生，基于此原理開發(fā)的GMR生物傳感器具有高靈敏度、低成本、寬探測范圍等優(yōu)點[82]。利用抗體-抗原相互作用(如鏈霉親和素與生物素)將生物分子化的寡核苷酸探針、靶DNA和磁性納米團簇依次固定在傳感器上，在外置磁場的作用下，由于巨磁阻效應，傳感器測得的電阻值將發(fā)生變化。當LAMP反應時，記錄并比較前后的電阻值變化，電阻值變化的2倍大于參考值則為陽性。Zhi等[83]將生物素作為生物分子，利用該方法檢測到了10個拷貝/mL的B型乙肝病毒。

5.3 壓電石英生物傳感器

石英晶體微天平(quartz crystal microbalance，QCM)利用了石英晶體的壓電效應，將石英晶體電極表面的質(zhì)量變化轉(zhuǎn)化為石英晶體振蕩電路輸出電信號的頻率變化，進而通過計算機等其他輔助設備獲得高精度的質(zhì)量數(shù)據(jù)。在QCM表面修飾鏈霉親和素、LAMP引物修飾生物素，當LAMP反應時，生物素化的LAMP產(chǎn)物結(jié)合到QCM表面上，引起QCM信號變化[84]。根據(jù)QCM信號與LAMP濃度之間的關系進行換算，即可得到LAMP反應的擴增效率[84-85]。Prakrankamanant等[84]利用該方法檢測人乳頭瘤病毒DNA 58型，得到了100個拷貝的檢測限。

5.4 表面增強拉曼散射生物傳感器

表面增強拉曼散射(surface-enhanced raman scattering，SERS)效應是一種與粗糙表面相關的表面增強效應，通常發(fā)生在Ag、Au和Cu等具有粗糙表面的納米粒子上[86]。在金納米粒子上修飾與LAMP擴增產(chǎn)物部分互補的寡核苷酸鏈和拉曼活性染料，當存在靶標時，LAMP反應產(chǎn)生的大量LAMP擴增產(chǎn)物與金納米探針雜交，雜交雙鏈不能被S1核酶(一種特異性單鏈核苷酸內(nèi)切酶)降解，因而保持較高的拉曼信號；當不存在靶DNA時，金納米探針的寡核苷酸鏈被S1核酶分解，拉曼信號降低。該方法的檢測靈敏度較高，可以檢測到66 CFU/mL的沙門氏菌[87]。

各類生物傳感器的特點各異，使用時應根據(jù)所需的靈敏度、特異性以及預算成本進行選擇。因此，對各種主要輸出方式的特點進行了比較，具體見表2。

6 展望

LAMP作為新興的基因擴增技術具有快速擴增、操作簡單和易于檢測等優(yōu)點，因此近年來獲得了突飛猛進的研究進展。然而，根據(jù)對LAMP生物傳感器的總結(jié)發(fā)現(xiàn)其還存在以下不足：LAMP引物設計復雜，優(yōu)化條件費時費力；引物互補易出現(xiàn)非特異性條帶，導致產(chǎn)生假陽性的結(jié)果；整個實驗過程中也容易被氣溶膠污染，使陰性對照組出現(xiàn)擴增條帶。而且，目前LAMP的檢測和輸出方式大多停留在簡單體系，較少應用于食品、動植物等的現(xiàn)場快速檢測。此外，關于目前發(fā)展前景較好的微流控技術，也還存在設計復雜、工作量大且價格昂貴等問題。

若要突破研究中的瓶頸、解決技術上的不足，可加強對LAMP反應機理的研究，提供強有力的理論支持，從而引入更多創(chuàng)新的檢測信號的方法，也有助于建立健全高效的LAMP引物設計和LAMP反應體系優(yōu)化系統(tǒng)。而針對LAMP非特異性擴增造成的假陽性，可以通過增強劑或特殊方法提高LAMP的特異性。目前，LAMP檢測的靈敏度較高，可以適當降低檢測的靈敏度，將靈敏度控制在實用范圍內(nèi)即可，應更多地針對LAMP擴增過程中除擴增產(chǎn)物外的產(chǎn)物(如焦磷酸根和Mg2+)，開發(fā)簡單、快速、實用并且相對靈敏和可靠的生物傳感器。為了使LAMP更廣泛的應用于現(xiàn)場快速檢測，研究內(nèi)容應該延伸到復雜的體系中，并研究其他體系環(huán)境的影響因素，并建立完整、實用的檢測方法；輸出方式也應該更多的向小型化、自動化發(fā)展，使操作更為簡易，適合于非專業(yè)人員現(xiàn)場檢測；同時，傳感器的設計應向電化學技術方向發(fā)展，因為相比于光學技術，電子傳感器具有更高的靈敏度，而且更易實現(xiàn)小型化、自動化。

表2 各種LAMP信號檢測方法的比較Table 2 Comparison of various LAMP signal detection methods