粟元,李舒婷,許文濤,2*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部轉(zhuǎn)基因生物食用安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京),北京 100083

生物傳感器種類多樣，是基于物理、化學(xué)、生物的高新技術(shù)，在各行各業(yè)中被廣泛應(yīng)用。生物傳感器具有許多優(yōu)點(diǎn)，如對(duì)多種靶標(biāo)選擇性好、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短等。近年來(lái)，氣體生物傳感器漸漸走進(jìn)人們視野，它是一類輸出信號(hào)為氣體的生物傳感器，主要利用酶實(shí)現(xiàn)氣體信號(hào)的轉(zhuǎn)化，其設(shè)計(jì)方式多樣，輸出方式簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，氣體從無(wú)到有，從而使得背景值較低。

目前，氣體生物傳感器多是將識(shí)別信號(hào)轉(zhuǎn)化為顏色從而實(shí)現(xiàn)對(duì)各種靶物質(zhì)如microRNA、癌細(xì)胞、端粒酶等的檢測(cè)，氣體信號(hào)表征方式較單一，且應(yīng)用范圍有一定限制。粟元等[1]在前文中綜述了氣體生物傳感器識(shí)別機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)展。本文將從氣體信號(hào)輸出的角度出發(fā)，介紹不同氣體生物傳感器的優(yōu)缺點(diǎn)，這有利于搭建不同種類的氣體生物傳感器；然后分類闡述蛋白酶介導(dǎo)的氣體生物傳感器、核酸酶介導(dǎo)的氣體生物傳感器、模擬酶介導(dǎo)的氣體生物傳感器和其他氣體生物傳感器的原理和應(yīng)用，這有利于總結(jié)除顏色以外的信號(hào)表征輸出方式，如氣體濃度、氣壓和pH；最后，對(duì)氣體生物傳感器的檢測(cè)手段和應(yīng)用前景提出了展望。

1 氣體生物傳感器

表1 多種氣體生物傳感器的對(duì)比Table 1 Comparison of different type of gas biosensors

2 氣體生物傳感器的應(yīng)用

目前，氣體生物傳感器的應(yīng)用主要集中在利用蛋白酶、核酸酶、模擬酶，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌、miRNA生物標(biāo)志物、毒素、塑化劑等靶物質(zhì)的檢測(cè)，利用生物細(xì)胞和生化反應(yīng)搭建體系的研究較少。

2.1 蛋白酶介導(dǎo)的氣體生物傳感器

2.1.1脲酶(urease)脲酶是由植物、真菌和細(xì)菌產(chǎn)生的一種含鎳酶，它催化尿素水解成氨和氨基甲酸酯。脲酶在生物化學(xué)中具有重要的歷史意義，它是第一個(gè)被結(jié)晶的酶。目前，有研究利用脲酶水解尿素產(chǎn)生氨氣，使溶液pH變化，建立pH與靶物質(zhì)的濃度間的關(guān)系從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶物質(zhì)的檢測(cè)，該傳感器應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，結(jié)果令人滿意。如Chen等[2]在黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)抗原上標(biāo)記脲酶，靶標(biāo)與脲酶標(biāo)記的AFB1抗原競(jìng)爭(zhēng)，被抗體捕獲。脲酶可催化尿素水解生成氨，誘導(dǎo)溶液pH升高，使用手持式pH計(jì)或pH敏感染料可以輕松檢測(cè)到變化。在優(yōu)化條件下，pH的增強(qiáng)與AFB1濃度的對(duì)數(shù)在0.62～23.42之間呈線性關(guān)系。圖1顯示了基于競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的AFB1生物傳感器的工作原理。另外，也有研究利用氨分子與銀離子間的作用使體系顏色發(fā)生變化，建立顏色與靶物質(zhì)的濃度間的關(guān)系從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶物質(zhì)的檢測(cè)，該傳感器檢測(cè)限較低。Pei等[3]設(shè)計(jì)了用標(biāo)記脲酶的OTA作為競(jìng)爭(zhēng)抗原將尿素水解成氨，在氨分子存在下，銀離子被葡萄糖中的甲?；€原，在金納米花(33 nm，AuNFs)表面生成銀殼，溶液的顏色由藍(lán)色變?yōu)樽丶t色。

2.1.2辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)1976年，Welinder等[4]首次確定了HRP-C是一組單亞基糖蛋白，是一種以亞鐵血紅素為氧化還原中心的過(guò)氧化物酶，之后其被廣泛地應(yīng)用在廢水處理、食品工業(yè)、有機(jī)合成和分析檢測(cè)等領(lǐng)域。目前，研究主要利用HRP催化體系產(chǎn)生的氣體與3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)之間的作用產(chǎn)生顏色變化這一原理設(shè)計(jì)傳感器檢測(cè)靶物質(zhì)。如Wang等[5]將HRP與羧基官能化碳納米管共價(jià)偶聯(lián)，體系中的H2O2可進(jìn)一步氧化TMB底物，得到比色產(chǎn)物。Zhu等[6]設(shè)計(jì)了基于HRP的用于檢測(cè)痕量鄰苯二甲酸二丁酯(din-butyl phthalate，DBP)的比色免疫傳感器，利用Cu(II)還原為Cu(I)，從而抑制HRP催化無(wú)色TMB氧化成藍(lán)色TMB。

2.1.3過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)目前，研究主要利用過(guò)氧化氫酶能夠與底物過(guò)氧化氫作用產(chǎn)生氣體這一原理開(kāi)發(fā)生物傳感器，也有研究將過(guò)氧化氫酶制備成膜與其他物質(zhì)結(jié)合增強(qiáng)催化性能。如Seetharamaiah等[7]提出了一種利用金屬離子配位組裝技術(shù)在石墨電極上制備的一維金納米結(jié)構(gòu)和CAT多層膜的電化學(xué)生物傳感器。Mohd[8]研究了基于過(guò)氧化氫酶標(biāo)記抗體的常規(guī)ELISA程序，即酶消耗過(guò)氧化氫，并通過(guò)添加金(III)氯化物進(jìn)一步產(chǎn)生金納米粒子，溶液中殘留的過(guò)氧化氫的量決定了金納米粒子溶液是呈現(xiàn)藍(lán)色還是呈現(xiàn)紅色。

圖1 基于競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的AFB1生物傳感器的工作原理[2]Fig.1 Working principle of AFB1 biosensor based on competitive enzyme-linked immunosorbent test[2]

2.2 核酸酶介導(dǎo)的氣體生物傳感器

G-四鏈體(G-quadruplexes)是一種特殊的DNA結(jié)構(gòu)，是由富G核酸序列中4個(gè)鳥(niǎo)嘌呤(guanine,G)兩兩間形成2個(gè)霍氏氫鍵圍成的正方片層堆疊而成[9]。氯高鐵血紅素(hemin)作為相互作用劑，通過(guò)直接堆積或嵌入G-四鏈體形成氯化血紅素/G-四鏈體(hGQ)而與分子內(nèi)G-四鏈體結(jié)構(gòu)相互作用[10]。

目前，許多研究利用氯化血紅素/G-四鏈體作為新型催化劑，催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生氧氣，并與TMB、ABTS等物質(zhì)結(jié)合，使體系顏色發(fā)生變化，從而開(kāi)發(fā)了各種生物傳感器。Zhang等[11]采用等溫比色法擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物中的CaMV 35S啟動(dòng)子序列。在體系中，G-四鏈體與Hemin形成具有過(guò)氧化物酶活性的DNA酶，催化H2O2介導(dǎo)的生色酶底物2,2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽離子[2,2′-diazo-bis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt ion，ABTS2-]的氧化導(dǎo)致綠色產(chǎn)物的形成。

2.3 模擬酶介導(dǎo)的氣體生物傳感器

2.3.1納米酶 各種納米材料，如貴金屬納米顆粒、碳基納米顆粒、金屬氧化物納米顆粒、金屬硫化物納米顆粒、復(fù)合納米顆粒，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有擬過(guò)氧化物酶活性，研究集中在通過(guò)納米酶催化底物TMB、ABTS產(chǎn)生有色物質(zhì)實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)或檢測(cè)體系氣體壓力，由此設(shè)計(jì)不同氣體生物傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)不同靶物質(zhì)的定量檢測(cè)。

納米酶分為基于非金屬納米材料的納米酶和基于金屬納米材料的納米酶?；诜墙饘偌{米材料的納米酶常見(jiàn)的如碳納米材料。Hayat等[12]提出了具有類過(guò)氧化物酶活性的在碳納米管(carbon nano tube,CNT)表面上摻入氧化鋅納米顆粒(ZnO)的納米復(fù)合材料。

全國(guó)政協(xié)常委、副秘書(shū)長(zhǎng)、新教育發(fā)起人朱永新在主旨演講中指出，公私合作、民辦學(xué)校的分類管理及小微學(xué)校的合法化是當(dāng)前體制改革的熱點(diǎn)；國(guó)家教育發(fā)展研究中心教育體制改革研究室主任王烽對(duì)當(dāng)前深化辦學(xué)體制改革的幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題進(jìn)行了解讀；北京師范大學(xué)教授曾曉東和臺(tái)灣振鐸學(xué)會(huì)理事長(zhǎng)丁志仁分別就美國(guó)的“擇?！爆F(xiàn)象及臺(tái)灣實(shí)驗(yàn)教育的立法與實(shí)踐等話題與參會(huì)者進(jìn)行了深入探討。

基于金屬納米材料的納米酶包括金納米粒子、鉑納米粒子、銅納米粒子和Fe3O4磁納米粒子。金納米粒子(AuNPs)的過(guò)氧化物酶樣活性遵循Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)模型，并且依賴于環(huán)境pH和溫度，這與HRP非常相似。與HRP不同的是AuNPs的活性非常高，即使H2O2濃度比HRP低兩個(gè)數(shù)量級(jí)，AuNPs只需要較低H2O2濃度在很窄范圍內(nèi)也能達(dá)到最大反應(yīng)速率并避免酶中毒[13]。Ding等[14]制備了三元金屬雜化納米粒子(FePt-Au HNPs)，其具有優(yōu)異的過(guò)氧化物酶活性。Shi等[15]用磁珠(MB)和鉑納米顆粒(PtNPs)催化H2O2產(chǎn)生大量的O2，通過(guò)檢測(cè)氣體壓力值測(cè)定靶標(biāo)。這比之前的許多報(bào)告更敏感。Liu等[16]通過(guò)將目標(biāo)響應(yīng)水凝膠與壓力計(jì)讀數(shù)相結(jié)合，當(dāng)靶物質(zhì)存在時(shí)，刺激水凝膠反應(yīng)允許釋放預(yù)載的PtNPs，將H2O2分解為O2。然后，在密封環(huán)境中產(chǎn)生的O2導(dǎo)致顯著的壓力增加，這可以通過(guò)手持式壓力計(jì)容易地讀出。使用這種基于目標(biāo)的水凝膠壓力測(cè)定，可以實(shí)現(xiàn)便攜式和高靈敏度的可卡因、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)和鉛離子檢測(cè)，具有出色的準(zhǔn)確度和選擇性，圖2顯示了其原理。Borghei等[17]開(kāi)發(fā)了一種基于DNA模板化銅納米團(tuán)簇(DNA-CuNCs)的過(guò)氧化物酶，通過(guò)它可以構(gòu)建簡(jiǎn)便、廉價(jià)、快速的比色法。Chen等[18]制備了具有類過(guò)氧化物酶作用的Fe3O4納米纖維，并建立了檢測(cè)L-半胱氨酸的敏感平臺(tái)，對(duì)L-半胱氨酸的選擇性優(yōu)于其他氨基酸、葡萄糖和金屬離子。

關(guān)于這幾種材料所結(jié)合的方法、原理和檢測(cè)限的比較如表2所示，雖然檢測(cè)的靶標(biāo)不一致，但所構(gòu)建的原理可以參考，并根據(jù)該方法可以結(jié)合當(dāng)前各材料的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)進(jìn)行優(yōu)化并超越。

表2 不同納米材料模擬酶的比較Table 2 Comparison of different nanomaterials mimic enzymes

2.3.2金屬有機(jī)骨架(metal-organic frameworks，MOFs)金屬有機(jī)骨架是一類由金屬離子或簇與有機(jī)連接基團(tuán)在相對(duì)溫和的條件下自組裝形成的混合材料[19]。MOFs 屬于一種新興的結(jié)晶分子功能材料，具有很多特性，其中包括：超高的孔隙率、優(yōu)異的結(jié)構(gòu)可調(diào)性、巨大的內(nèi)部表面積、結(jié)構(gòu)多樣性、高的化學(xué)穩(wěn)定性和強(qiáng)大的熱穩(wěn)定性等[20-21]，同時(shí)還具有催化活性[22]。

目前，主要利用MOFs的類過(guò)氧化物酶活性與底物過(guò)氧化氫作用設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)氣體生物傳感器。Qi等[23]設(shè)計(jì)并制造了一種能夠?yàn)檫^(guò)氧化氫的催化反應(yīng)發(fā)出熒光的PA-Tb-Cu MOF納米酶。Li等[24]合成了柱狀多金屬氧酸鹽金屬有機(jī)骨架[Cu5(pz)6Cl][SiW12O40] (CuSiW12)。值得注意的是其類過(guò)氧化物酶活性優(yōu)于原硅鎢酸，且體系具有靈敏度高、線性范圍寬、檢測(cè)下限低、對(duì)H2O2的響應(yīng)時(shí)間快(2 min)等特點(diǎn)。

2.3.3小分子物質(zhì) 熒光素是一類小分子物質(zhì)，因其多功能的熒光特性，在醫(yī)學(xué)、生物成像和生物傳感等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。熒光素介導(dǎo)的氣體生物傳感器的應(yīng)用主要集中在利用它們的擬過(guò)氧化物酶性能，其功能與天然氧化酶相同。與HRP相比，熒光素對(duì)TMB表現(xiàn)出更高的親和力，主要通過(guò)與顯色底物如TMB、鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)和ABTS作用發(fā)生顏色變化實(shí)現(xiàn)對(duì)靶物質(zhì)的檢測(cè)。Li等[25]研究了2′,7′-二氟熒光素(2′,7′-difluorofluorescein，DFF)的過(guò)氧化物酶樣活性，其可以催化H2O2氧化TMB以產(chǎn)生藍(lán)色氧化產(chǎn)物。值得注意的是，DFF顯示出比熒光素和2′,7′-二氯熒光素(2′,7′-dichlorofluorescein，DCF)更高的過(guò)氧化物酶樣活性。

2.4 生物細(xì)胞介導(dǎo)的氣體生物傳感器

目前，利用生物細(xì)胞構(gòu)建酶基因表達(dá)催化底物產(chǎn)生氣體的生物傳感器很少，具有催化活性的生物細(xì)胞較多。Liu等[26]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌脲酶(BpUrease)是一種有前景的生物催化劑。由此可設(shè)計(jì)用特定變體有效降解模型黃酒中的尿素和乳油產(chǎn)生氣體。Ripolles[27]研究開(kāi)發(fā)了過(guò)氧化物生物檢測(cè)器，評(píng)估了一系列過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性細(xì)菌：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、銅綠假單胞菌、腸沙門(mén)氏菌。形成生物膜的所有過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性食源性病原體均在生物檢測(cè)器的檢測(cè)中顯示陽(yáng)性，檢測(cè)到的最小微生物負(fù)荷為104CFU/cm2，最強(qiáng)烈的陽(yáng)性反應(yīng)是銅綠假單胞菌。利用生物細(xì)胞表達(dá)基因或直接催化底物產(chǎn)生氣體，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)氣體生物傳感器用于檢測(cè)靶物質(zhì)具有廣闊前景。

2.5 生化反應(yīng)介導(dǎo)的氣體生物傳感器

對(duì)于生物體，體內(nèi)體外都存在許多產(chǎn)生氣體的生化反應(yīng)，例如三羧酸循環(huán)產(chǎn)氧和二氧化碳，水果、酒、泡菜、面團(tuán)發(fā)酵產(chǎn)生香味，垃圾貯存產(chǎn)生氨氣、硫化氫等。在一定情況下，可根據(jù)產(chǎn)氣情況對(duì)食品質(zhì)量進(jìn)行分析控制。然而，目前利用生化反應(yīng)構(gòu)建的生物傳感器比較罕見(jiàn)。

通過(guò)將靶物質(zhì)與催化產(chǎn)生氣體的物質(zhì)相連接，構(gòu)建氣體生物傳感器，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)速率升高或降低存在動(dòng)態(tài)變化，能夠構(gòu)建相關(guān)性關(guān)系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶物質(zhì)的檢測(cè)，且不需使用高效液相色譜儀等大型儀器來(lái)檢測(cè)氣體信號(hào)。

圖2 靶向響應(yīng)水凝膠壓力法的工作原理[16]Fig.2 Working principle of target response hydrogel pressure method[16]

3 展望

本文結(jié)合生物技術(shù)和化學(xué)技術(shù)，介紹了通過(guò)酶搭建的氣體生物傳感器，分類綜述了氣體生物傳感器的應(yīng)用，總結(jié)了當(dāng)下利用氣體生物傳感器方法的檢測(cè)現(xiàn)狀，目前氣體生物傳感器在功能核酸檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用還較少且比較單一，而關(guān)于結(jié)合生物技術(shù)和氣體濃度分析檢測(cè)靶物質(zhì)的研究還未見(jiàn)報(bào)道，這種新的信號(hào)策略將為簡(jiǎn)單、便攜、高靈敏度分析檢測(cè)靶物質(zhì)開(kāi)辟一條新途徑。

近年來(lái)，食品安全問(wèn)題層出不窮，食品檢測(cè)技術(shù)仍舊面臨著巨大的挑戰(zhàn)，每年都會(huì)有新產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)，因此對(duì)食品的檢測(cè)和安全性評(píng)價(jià)至關(guān)重要，基于氣體生物傳感器的檢測(cè)方法在多方面都有很廣闊的發(fā)展前景。

3.1 檢測(cè)設(shè)備的智能化、穩(wěn)定化

氣體濃度和壓力的測(cè)量沒(méi)有光學(xué)或磁場(chǎng)噪聲，氣體濃度儀和氣壓計(jì)對(duì)氣體敏感，檢測(cè)速度快，未來(lái)可以設(shè)計(jì)能與手機(jī)相連接的檢測(cè)設(shè)備，通過(guò)手機(jī)就能夠智能控制、監(jiān)測(cè)和分析；氣體容易散失，有些氣體易溶于水，可以根據(jù)氣體的不同性質(zhì)設(shè)計(jì)氣體發(fā)生裝置收集氣體，使檢測(cè)結(jié)果能夠更加穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠。

3.2 模擬酶種類增加

近年來(lái)，人工模擬酶成本低廉、穩(wěn)定性高、催化活性高、易于儲(chǔ)存，且能有效降低干擾物的影響，未來(lái)可以設(shè)計(jì)更多方式方法開(kāi)發(fā)制備種類多樣、高效催化的人工酶，還可以將納米材料、金屬有機(jī)骨架等性能優(yōu)良的不同材料復(fù)合使用，對(duì)比篩選出高效模擬酶使其應(yīng)用更加廣泛。

3.3 檢測(cè)方法的通用性、均向性

利用酶催化底物取代傳統(tǒng)的化學(xué)催化或物理反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程副產(chǎn)物較少，且簡(jiǎn)化了工藝、節(jié)省了設(shè)備、降低了危險(xiǎn)且減少了污染等，反應(yīng)體系的信號(hào)識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)化、信號(hào)輸出的一體化形成了循環(huán)放大，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)更多靶物質(zhì)的均向檢測(cè)，未來(lái)可以增加氣體生物傳感器的通用性。

3.4 檢測(cè)領(lǐng)域的擴(kuò)大以及多重檢測(cè)

總體而言，基于上述原理可開(kāi)發(fā)制備大量更高效、更多元、更完善的氣體生物傳感器，同時(shí)檢測(cè)對(duì)象可進(jìn)一步擴(kuò)大，如應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因、重金屬、違法添加物質(zhì)、生物標(biāo)志物、生物毒素、病原微生物等靶標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)，未來(lái)氣體生物傳感器的利用潛力非常大，且檢測(cè)領(lǐng)域極為廣泛。

另外，氣體生物傳感器具有識(shí)別單一或復(fù)雜成分氣味的能力，當(dāng)一種靶物質(zhì)對(duì)應(yīng)一種氣體時(shí)可以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量檢測(cè)；當(dāng)反應(yīng)體系產(chǎn)生幾種氣體時(shí)，可以同時(shí)檢測(cè)多種靶物質(zhì)，或者將氣體信號(hào)分子與熒光信號(hào)分子、電化學(xué)信號(hào)分子等結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)多重靶標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)，這對(duì)食品安全和核酸檢測(cè)研究具有重大的意義。