王心一,劉榜,諶陽,許文濤,周翔*

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué),農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083

羊肉產(chǎn)業(yè)是我國肉類產(chǎn)業(yè)的重要支柱之一，消費(fèi)需求旺盛[1]。近年來，我國多地爆出“羊肉摻假”事件[2]，羊肉摻假不僅會帶來食品安全隱患，還可能嚴(yán)重危害消費(fèi)者的身體健康。建立快速、準(zhǔn)確的動物源性成分檢測技術(shù)是保障肉制品安全的關(guān)鍵。目前用于動物源性成分檢測的方法較多，主要分為形態(tài)學(xué)檢測、基于蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)、基于光譜的檢測技術(shù)和基于核酸的檢測技術(shù)[3]。以抗原抗體特異性結(jié)合這一特征為基礎(chǔ)，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法，通過分析被檢樣品的蛋白質(zhì)，可以快速檢測煮熟的馬、牛、雞和羊等肉制品中豬肉的含量[4]；利用可見光和近紅外反射光譜，記錄分子吸收紅外光之后所呈現(xiàn)的振動模式，也可用于區(qū)分牛、駝、馬3種家畜的肉樣[5]。而基于核酸的檢測技術(shù)可分為等溫擴(kuò)增和變溫擴(kuò)增(主要為PCR)2種，運(yùn)用LAMP技術(shù)在等溫條件下使核酸進(jìn)行快速擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)山羊奶、肉樣品中摻雜的牛DNA的快速檢測[6]；也可利用多重PCR技術(shù)，對肉樣中的狐貍、水貂、狗、兔的源性成分進(jìn)行同時檢測[7]。但隨著研究的深入，這些檢測技術(shù)逐漸出現(xiàn)一定的局限性，如成本高、對產(chǎn)品的加工方式有一定限制、對操作人員具有較高的專業(yè)性要求等。而對肉類食品進(jìn)行源性成分的檢測是食品安全監(jiān)控中必不可少的一環(huán)，因此，需要建立更為簡便、靈敏的檢測技術(shù)來保障肉類食品的安全。

G-四聯(lián)體(G-quadruplex)是一段富含鳥嘌呤(G)的DNA序列，通過氫鍵(Hoogsteen)作用形成的一種非典型DNA二級結(jié)構(gòu)[8]。這種富G序列因存在于人體端粒DNA中而被廣泛研究[9]。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)G-四聯(lián)體在陽離子(如K+)的作用下可以結(jié)合氯高鐵血紅素(hemin)形成具有DNA核酶(DNAzyme)活性的G-四聯(lián)體-hemin復(fù)合物，該復(fù)合物所具有的酶活性可以催化H2O2氧化2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基-苯并噻唑琳-6-磺酸)二胺鹽[2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt，ABTS2-]為ABTS-，溶液從無色變?yōu)榫G色[10]。因其實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用肉眼直接觀察，無需任何特殊儀器，且成本較低，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對尿嘧啶-DNA糖基化酶(uracil-DNA glycosylase，UDG)[11]、人急性淋巴白血病細(xì)胞[12]等的檢測。而G-四聯(lián)體的形成依賴于含有特定序列的DNA鏈，這就需要通過核酸擴(kuò)增手段獲得。Gyllensten和Erlich[13]首次發(fā)現(xiàn)了不對稱PCR(asymmetric PCR，As-PCR)具有同時產(chǎn)生雙鏈DNA(double strand，dsDNA)和單鏈DNA(single strand，ssDNA)的特征。在As-PCR反應(yīng)體系中加入不等量的正向引物和反向引物，濃度高的稱為非限制性引物，濃度低的稱為限制性引物。在限制性引物消耗完之前經(jīng)As-PCR擴(kuò)增出少量dsDNA，消耗完畢后，非限制性引物會繼續(xù)擴(kuò)增出大量ssDNA，ssDNA可用于探針雜交[14]或作為G-四聯(lián)體檢測的重要原料。研究表明，通過在限制性引物的一端加上一段特定的G-四聯(lián)體反向互補(bǔ)序列，以目標(biāo)物種的基因組DNA為模板，經(jīng)過As-PCR擴(kuò)增，可產(chǎn)生大量帶有G-四聯(lián)體序列的ssDNA[15]。本研究結(jié)合As-PCR技術(shù)與G-四聯(lián)體的功能特點(diǎn)，建立一種G-四聯(lián)體比色生物傳感器，具體原理見圖1，以期實(shí)現(xiàn)對肉制品中羊源性成分快速、準(zhǔn)確的檢測，并為動物源性成分檢測提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所使用的羊、牛、豬、雞、鴨樣品均來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。ABTS2-購自美國Sigma公司；氯高鐵血紅素(hemin)購自北京索萊寶科技有限公司；其他主要試劑均為國產(chǎn)分析純。DNA純化回收試劑盒購自美國US Everbright公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA的提取 采用氯仿苯酚法提取樣品基因組DNA[16]，DNA濃度通過核酸測定儀檢測獲得。

1.2.2引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)As-PCR技術(shù)的特點(diǎn)，將正向引物設(shè)置為限制性引物，反向引物設(shè)置為非限制性引物，并在正向引物的5′端加上一段G-四聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列。正向引物(Sheep-F)序列為：5′-TCCCACCCACCCACCCAGGCAAGAATGGCACCCAAGAC-3′，其中5′-TCCCACCCACCCAC-CCAG-3′為分子內(nèi)平行G-四聯(lián)體序列EAD[C(TG3)4A][17]的反向互補(bǔ)序列；反向引物(Sheep-R)序列為：5′-TGCCATGTGTGCCGCATTTG-3′。

圖1 G-四聯(lián)體比色生物傳感器原理圖Fig.1 The principle of the colorimetric biosensor based on G-quadruplex

1.2.3As-PCR反應(yīng)體系和條件優(yōu)化 以羊的基因組DNA為模板進(jìn)行As-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化。反應(yīng)體系：2 μL 10×PCR Buffer，1.6 μL dNTP Mix(各2.5 mmol/L)，0.1 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)，1 μL DNA模板(50 ng/μL)，加雙蒸水至20 μL。正、反向引物濃度比例的梯度設(shè)置如表1所示，另將退火溫度設(shè)置為58、60、61、62、64 ℃ 5個梯度。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳(130 V，40 min)進(jìn)行鑒定，利用凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行觀察分析。

表1 As-PCR引物濃度比例梯度表Table 1 As-PCR primer concentration gradient table

1.2.4As-PCR產(chǎn)物回收 采用DNA純化回收試劑盒對As-PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，具體的操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.5G-四聯(lián)體比色生物傳感器的有效性驗(yàn)證

在20 μL As-PCR回收產(chǎn)物中加入55 μL的顯色緩沖液，顯色緩沖液的具體組成為：25 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES]、200 mmol/L NaCl、20 mmol/L KCl、0.05% Triton-X、1%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、20 mmol/L MgCl2?；靹蚝笥?0 ℃水浴鍋中加熱10 min以去除二級結(jié)構(gòu)，冷卻至室溫后再加入2 μL的hemin(50 μmol/L)溶液，混勻后室溫避光孵育1 h。隨后加入20 μL的ABTS2-(30 mmol/L)和2 μL的H2O2(100 mmol/L)，室溫避光反應(yīng)至變色。

1.2.6G-四聯(lián)體比色生物傳感器的物種特異性檢測 分別以同等質(zhì)量和濃度的羊、牛、豬、雞、鴨5種常見食用肉類的基因組DNA為模板，按照已經(jīng)優(yōu)化好的體系進(jìn)行As-PCR，再利用回收產(chǎn)物進(jìn)行G-四聯(lián)體比色反應(yīng)，以檢測該生物傳感器的物種特異性。

1.2.7G-四聯(lián)體比色生物傳感器的靈敏度檢測

將羊的基因組DNA稀釋，分別得到含200.0、20.0、2.0、0.2、0.0 ng的樣品，按照已經(jīng)優(yōu)化好的體系進(jìn)行As-PCR，再利用回收產(chǎn)物進(jìn)行G-四聯(lián)體比色反應(yīng)，以檢測該生物傳感器的靈敏度。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該生物傳感器對于混合肉樣的靈敏度，在豬肉中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0%、0.5%、1.0%、5.0%、10.0%、50.0%、100.0%的羊肉樣品，混勻后進(jìn)行DNA提取，并按照已經(jīng)優(yōu)化好的體系進(jìn)行As-PCR，再利用回收產(chǎn)物進(jìn)行G-四聯(lián)體比色反應(yīng)，以檢測在混合肉樣該生物傳感器的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 As-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

As-PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果見圖2A，當(dāng)退火溫度為61 ℃時，擴(kuò)增出2條相對較亮的目的條帶，且無明顯雜帶。As-PCR正、反向引物濃度比例優(yōu)化結(jié)果見圖2B。正、反向引物濃度比為1∶5和1∶12.5的As-PCR反應(yīng)產(chǎn)物中出現(xiàn)2條區(qū)分明顯的目的條帶，其中，As-PCR擴(kuò)增出的dsDNA與普通PCR(即正、反向引物濃度比為1∶1)產(chǎn)物目的片段大小(255 bp)一致，且正、反向引物濃度比為1∶12.5的As-PCR擴(kuò)增出的ssDNA條帶(225 bp)較亮,且遷移速度與dsDNA相比較快。而正、反向引物濃度比為1∶25、1∶50、1∶100的As-PCR出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，無法區(qū)分dsDNA與ssDNA。綜上所述，As-PCR體系的最優(yōu)退火溫度為61 ℃，最優(yōu)正、反向引物濃度比例為1∶12.5，優(yōu)化后的反應(yīng)體系見表2。

A：不同退火溫度下As-PCR產(chǎn)物的電泳圖 M—Marker DL2000，1—58 ℃，2—60 ℃，3—61 ℃，4—62 ℃，5—64 ℃；B：不同正、反向引物濃度比例下As-PCR產(chǎn)物的電泳圖 M—Marker DL2000，1—1∶1，2—1∶5，3—1∶12.5，4—1∶25，5—1∶50，6—1∶100。圖2 As-PCR反應(yīng)條件和體系的優(yōu)化Fig.2 Optimization of As-PCR reaction conditions and system

2.2 G-四聯(lián)體比色生物傳感器的有效性驗(yàn)證

以羊基因組DNA(含量為200 ng)為模板，按照已經(jīng)優(yōu)化好的體系(表2)進(jìn)行As-PCR，以雙蒸水作為空白對照。由圖3A可知，空白對照未擴(kuò)增出任何目的條帶，而含有羊基因組DNA的樣品擴(kuò)增出2條區(qū)分明顯的目的條帶。將As-PCR產(chǎn)物純化回收，并進(jìn)行G-四聯(lián)體比色反應(yīng)。由圖3B可知，空白對照的顏色無明顯變化，而含有羊基因組DNA的As-PCR產(chǎn)物經(jīng)比色反應(yīng)后顏色從無色變?yōu)榫G色。結(jié)果表明，As-PCR擴(kuò)增出的ssDNA含有G-四聯(lián)體序列，可在K+的作用下與hemin結(jié)合下形成具有DNAzyme活性的G-四聯(lián)體-hemin復(fù)合物，從而催化H2O2氧化ABTS2-為ABTS-，使溶液顏色發(fā)生變化。這說明本研究所建立的G-四聯(lián)體比色生物傳感器可用于羊源性成分的檢測。

表2 As-PCR反應(yīng)體系Table 2 Reaction system of As-PCR

A：不同樣品的As-PCR產(chǎn)物的電泳圖 M—Marker DL2000，1—空白對照，2—羊基因組DNA；B：不同樣品的G-四聯(lián)體比色反應(yīng)結(jié)果 1—空白對照，2—羊基因組DNA。圖3 G-四聯(lián)體比色生物傳感器的有效性Fig.3 Validity of the colorimetric biosensor based on G-quadruplex

2.3 G-四聯(lián)體比色生物傳感器的物種特異性檢測

按照已經(jīng)優(yōu)化好的體系(表2)，分別以羊、牛、豬、雞和鴨的基因組DNA(含量均為200 ng)為模板進(jìn)行As-PCR，再利用回收產(chǎn)物進(jìn)行G-四聯(lián)體比色反應(yīng)，以雙蒸水作為空白對照，以檢測G-四聯(lián)體比色生物傳感器的物種特異性。從圖4可以看出，只有含目標(biāo)物種基因組DNA(即羊基因組DNA)的反應(yīng)體系的顏色發(fā)生明顯變化，其他含非目標(biāo)物種基因組DNA的反應(yīng)體系均未變色，表示本研究所建立的G-四聯(lián)體比色生物傳感器具有高度的物種特異性。

注：1—空白對照；2—羊基因組DNA；3—?；蚪MDNA；4—豬基因組DNA；5—雞基因組DNA；6—鴨基因組DNA。圖4 G-四聯(lián)體比色生物傳感器的物種特異性Fig.4 Species specificity of the colorimetric biosensor based on G-quadruplex

2.4 G-四聯(lián)體比色生物傳感器的靈敏度檢測

按照已經(jīng)優(yōu)化好的體系(表2)，分別以含200.0、20.0、2.0、0.2、0.0 ng羊基因組DNA的樣品為模板進(jìn)行As-PCR，再利用回收產(chǎn)物進(jìn)行G-四聯(lián)體比色反應(yīng)，以檢測G-四聯(lián)體比色生物傳感器的靈敏度。由圖5A可知，含量為200.0、20.0和2.0 ng羊基因組DNA的反應(yīng)體系顏色發(fā)生變化，而含量為0.2和0.0 ng的反應(yīng)體系顏色無明顯變化。即樣品中含2.0 ng的羊基因組DNA所產(chǎn)生的G-四聯(lián)體-hemin復(fù)合物，就足以對樣品中的羊源性成分進(jìn)行有效鑒別，表明本研究所建立的G-四聯(lián)體比色生物傳感器的檢出限為2.0 ng。

為了進(jìn)一步檢測該生物傳感器對于混合肉樣的靈敏度，將豬肉和羊肉樣品按不同比例進(jìn)行混合，使羊肉樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.0%、0.5%、1.0%、5.0%、10.0%、50.0%、100.0%，以雙蒸水作為空白對照。由圖5B可知，當(dāng)羊肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%、50.0%、10.0%、5.0%時，溶液顏色發(fā)生明顯變化，表明該生物傳感器在混合肉樣中羊肉樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時即可對樣品中的羊源性成分進(jìn)行有效鑒別。

A：不同的羊基因組DNA含量的檢測結(jié)果 1—200.0 ng，2—20.0 ng，3—2.0 ng，4—0.2 ng，5—0.0 ng；B：混合肉樣中不同的羊肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測結(jié)果 1—100.0%，2—50.0%，3—10.0%，4—5.0%，5—1.0%，6—0.5%，7—0.0%，8—空白對照。圖5 G-四聯(lián)體比色生物傳感器靈敏度Fig.5 Sensitivity of the colorimetric biosensor based on G-quadruplex

3 討論

近年來，多起肉類食品摻假事件的曝光，讓肉制品的真實(shí)性檢測成為了人們關(guān)注的熱點(diǎn)[18]?；诤怂岬臋z測技術(shù)因具有簡便快速、成本低、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于動物源性成分檢測[19]。G-四聯(lián)體的功能特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)較晚，且G-四聯(lián)體的DNAzyme活性常用于抗氧化測定技術(shù)的開發(fā)[20]、酶活性測定[21]和抗腫瘤的研究[22]等，因而涉及動物源性成分檢測的研究較少。目前，利用As-PCR技術(shù)產(chǎn)生G-四聯(lián)體進(jìn)而進(jìn)行動物源性成分檢測的相關(guān)研究未見報道。本研究所建立的G-四聯(lián)體比色生物傳感器可對羊源性成分進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，相比其他常規(guī)PCR技術(shù)而言，該方法無需經(jīng)過凝膠電泳、測序等常規(guī)步驟，在室溫下可用肉眼直接觀察結(jié)果。若樣品中含有目標(biāo)物種的基因組DNA，在特異性引物的作用下可擴(kuò)增出含有G-四聯(lián)體序列的ssDNA；若不存在目標(biāo)物種的基因組DNA，反應(yīng)體系中就只存在G-四聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列，無法形成具有DNAzyme活性的G-四聯(lián)體-hemin復(fù)合物。根據(jù)溶液不同的顏色變化，即可實(shí)現(xiàn)對不同動物源性成分的檢測。

G-四聯(lián)體的形成是檢測過程的關(guān)鍵步驟，當(dāng)hemin與G-四聯(lián)體形成具有脫氧核酶活性的復(fù)合物時，可以顯著增強(qiáng)hemin催化ABTS2-顯色的能力[23]。所以在設(shè)計(jì)限制性引物時，要選擇適當(dāng)?shù)腉-四聯(lián)體序列。G-四聯(lián)體的結(jié)構(gòu)具有多樣性，有分子內(nèi)平行構(gòu)型、分子間平行構(gòu)型、反平行構(gòu)型、平行構(gòu)型[8,24]，因此，不同的富G序列形成的G-四聯(lián)體-hemin復(fù)合物所具有的DNAzyme活性不同，選擇酶活性高的序列可提高整個反應(yīng)的靈敏度。根據(jù)已有的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)與DNAzyme活性之間相關(guān)性的研究結(jié)果[17]，本研究選擇了呈現(xiàn)分子內(nèi)平行G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的EAD序列[C(TG3)4A]，其具有較高的過氧化物酶活性。本研究所建立的生物傳感器的檢測靈敏度可達(dá)到2 ng，后續(xù)研究還需要尋找酶活性更高的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，使該生物傳感器的靈敏性得到進(jìn)一步提升。

本研究以羊基因組DNA為研究材料，結(jié)合As-PCR技術(shù)和G-四聯(lián)體的功能特點(diǎn)，建立了一種G-四聯(lián)體比色生物傳感器，該生物傳感器能夠穩(wěn)定檢測出的羊源性成分的最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，實(shí)現(xiàn)了對肉制品中羊源性成分快速、準(zhǔn)確的檢測。本研究所建立的G-四聯(lián)體比色生物傳感器具有特異性強(qiáng)、操作簡單、可視化等特點(diǎn)，為食品安全監(jiān)管部門提供了有效的技術(shù)支撐。