聶佩顯　于樹增　陳浪波　薛曉敏　王金政

摘要：以‘國光及其芽變材料為試材， 利用AFLP技術(shù)采用4對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，并對(duì)果實(shí)品質(zhì)和果皮色澤進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明：‘國光芽變材料在平均單果重、果實(shí)大小、可溶性固性物含量、果皮著色指數(shù)方面，均極顯著優(yōu)于母株;4對(duì)引物組合共擴(kuò)增出283條條帶，多態(tài)性條帶65條，多態(tài)性條帶比率為3736%，差異化片段大部分集中在100～400 bp，其中引物E75/M54多態(tài)性比率最高，達(dá)71.79%，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：蘋果;AFLP;芽變;鑒定

中圖分類號(hào)：S661.103.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）10-0021-04

Fruit Quality and AFLP Analysis of Ralls and Its Bud Mutation

Nie Peixian1， Yu Shuzeng2， Chen Langbo3， Xue Xiaomin1， Wang Jinzheng1

（1.Shandong Institute of Pomology， Taian 271000， China; 2.Wendeng Agricultural Bureau in Weihai， Weihai 264400， China;

3.Weihai Fruit Tree and Tea Workstation， Weihai 264200， China）

Abstract AFLP was used to identify Ralls and its bud mutation with 4 pairs of primers. Their fruit quality and pericarp colour were also compared. The results showed that the mutation was very significantly better than Ralls in average single fruit weight， fruit size， soluble solid content and pericarp coloring index. A total of 288 bands were amplified with the 4 pairs of primer combinations， in which， there were 65 polimophic bands with the polymorphism ratio as 37.36%. Most of the different fragments were concentrated in 100～400 bp. The polymorphism ratio was the highest with the primer combination E75/M54， reaching 71.79%， with high application value.

Keywords Apple; AFLP; Bud mutation; Identification

芽變是體細(xì)胞變異的一種，也是果樹育種的重要材料來源，在果樹育種中起重要作用[1]。蘋果是遺傳背景高度雜合的多年生木本植物，芽變頻率高，因此芽變選種在其育種中占有十分重要的地位[2]。為了排除外在環(huán)境條件所引起的彷徨變異或者飾變，需要對(duì)芽變材料進(jìn)行鑒定。目前，芽變鑒定方法已發(fā)展到分子水平，并在多種作物的遺傳鑒定分析中得以應(yīng)用 [3-6]，所用分子技術(shù)主要包括RAPD、AFLP、RFLP、ISSR、DNA甲基化等。與傳統(tǒng)品種鑒定方法相比，DNA分子標(biāo)記不受芽變材料生長時(shí)期、環(huán)境以及所取部位的影響，具有檢測結(jié)果可靠、耗時(shí)短、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)。

本研究以2001年10月在山東省威海市文登區(qū)澤頭鎮(zhèn)大宋家村發(fā)現(xiàn)的1株‘國光芽變材料為試材，以該地園區(qū)內(nèi)‘國光為對(duì)照，利用AFLP技術(shù)從分子水平上比對(duì)兩者的遺傳差異，并對(duì)果實(shí)品質(zhì)和果皮色澤進(jìn)行對(duì)比分析，旨在為蘋果芽變的鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇嫁接到紅富士植株上多年的‘國光芽變材料以及同一園區(qū)種植的芽變母株（CK）為試材，2017年10月中旬采果，部分樣品液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/MseⅠ和T4 DNA連接酶購自NEB公司;選擇性擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)測定參照文獻(xiàn)[7]的方法測定果實(shí)相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)。果實(shí)成熟后，分別選取30個(gè)果實(shí)，用精度0.1 g的天平稱量單果重;數(shù)字顯示游標(biāo)卡尺測定果實(shí)縱徑和橫徑，計(jì)算果形指數(shù);TD-45 型數(shù)字折光儀測定可溶性固形物含量;GY-1 型果實(shí)硬度計(jì)測定果實(shí)硬度。

1.3.2 果實(shí)著色指標(biāo)測定根據(jù)果實(shí)著色面積確定著色等級(jí)，并計(jì)算著色指數(shù)。用Konica Minolta CR410型色彩色差計(jì)測定果皮的L值、a值和b值，并計(jì)算c值和H值，c=√（a²+b²），H=arctan（b/a）[8]。其中，L值表示果面亮度，0為黑色，100為白色;a值表示果皮的紅綠色度，正值偏紅，負(fù)值偏綠，絕對(duì)值越大則表示紅色或者綠色越深;b值表示果皮的橙藍(lán)色度，正值偏橙，負(fù)值偏藍(lán)，絕對(duì)值越大則表示橙色或者藍(lán)色越深;c值表示果皮顏色的彩度，值越大顏色越純;H反映果皮紅橙黃綠藍(lán)及其過渡色的變化，變化范圍在0°～180°，當(dāng)H<50°時(shí)，值越小表示紅色越深，當(dāng)H>100°時(shí)，值越大表示綠色越深，0°為紫紅色、90°為黃色、180°為綠色。

1.3.3 AFLP分子標(biāo)記參照李元軍等[2]的方法進(jìn)行AFLP分析并稍作改動(dòng)。DNA的提取采用改良CTAB法;使用EcoRⅠ/MseⅠ對(duì)DNA進(jìn)行雙酶切，T4 DNA連接酶對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接;利用表1中的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增（引物E0/M0）和選擇性擴(kuò)增（引物分別為E45/M65、E75/M54、E86/M64、E86/M85）;6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物，銀染后拍照并記錄。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 18.0軟件進(jìn)行差異分析。

AFLP分析中某一條擴(kuò)增條帶出現(xiàn)時(shí)記為“1”，不存在記為“0”。遺傳相似系數(shù)（GS）采用Nei 和Li[9]的方法計(jì)算，GS=2Nij/（Ni+Nj）;多態(tài)性比率=（Ni+Nj-2Nij）/（Ni+Nj-Nij）×100%，Nij表示樣本i和j的共同條帶數(shù)，Ni、Nj分別為樣本i、j的條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)品質(zhì)的比較

由表2可以看出，與CK相比，芽變材料的平均單果重、果實(shí)縱徑和橫徑、可溶性固形物含量極顯著增加，分別提高16.27%、5.61%、6.74%、15.85%;果實(shí)硬度極顯著下降，降幅為5.00%;果形指數(shù)沒有明顯變化。

2.2 果實(shí)著色的比較分析

果品的色澤指標(biāo)是決定果實(shí)外觀品質(zhì)的重要因素之一。由表3可知，芽變材料和CK 的L值均大于50，但CK的果面亮度極顯著高于芽變材料，兩者表面亮度均偏亮。a值和H值均可表示果皮表面顏色在紅綠方向上的變化，芽變材料果皮色差a值偏大H值偏小，說明芽變材料果皮偏向紅色，這與肉眼觀察到的果實(shí)著色指數(shù)表現(xiàn)一致，且與CK相比，H值的差異達(dá)到極顯著水平。芽變材料b值、c值均顯著低于CK，說明CK較芽變材料果皮偏橙色，色彩較純。芽變材料的著色指數(shù)極顯著高于CK，著色面積較均勻。

2.3 可溶性固形物和果皮色差各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

本試驗(yàn)相關(guān)系數(shù)r標(biāo)準(zhǔn)為：0≤|r|<0.4為低度相關(guān)、0.4≤|r|<0.7為中度相關(guān)、0.7≤|r|<1為高度相關(guān)。芽變材料和CK的可溶性固形物含量與果皮色差各指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果（表4）顯示，兩者表現(xiàn)出較大差異，芽變材料可溶性固形物含量與L值、b值和H值均表現(xiàn)為中度負(fù)相關(guān)，與a值、c值呈中度正相關(guān);CK可溶性固形物含量與果皮色差各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)不明顯。

2.4 果皮色差各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

由表4可以看出，芽變材料果皮色差的L值與a值、c值呈中度負(fù)相關(guān)，與b值、H值呈高度正相關(guān);CK 果皮色差的L值與a值、c值呈高度負(fù)相關(guān)，與b值、H值呈高度正相關(guān)，均達(dá)到極顯著水平。

2.5 擴(kuò)增引物的篩選及分子多態(tài)性分析

以‘國光和其芽變材料DNA為模板，通過4對(duì)AFLP引物組合的PCR擴(kuò)增，結(jié)果（表5）顯示，4對(duì)引物組合共擴(kuò)增出283條清晰可辨的條帶，對(duì)照和芽變材料分別為130條和153條，共有條帶109條，多態(tài)性條帶65條。計(jì)算得遺傳相似系數(shù)為77.03%，多態(tài)性條帶比率為37.36%，差異化片段大部分集中在100～400 bp。

由圖1可知，每對(duì)引物均能在不同材料中擴(kuò)增出多個(gè)差異位點(diǎn)。E75/M54引物組合多態(tài)性比率最高，為71.79%;E86/M85引物組合次之，為63.63%;E86/M64和E45/M65引物組合多態(tài)性比率較低，分別為30.23%和5.08%。上述結(jié)果在一定程度上反映了芽變材料和‘國光中遺傳物質(zhì)的變異頻率，證實(shí)兩者在DNA分子水平上發(fā)生變化。

3 討論與結(jié)論

蘋果發(fā)生芽變后，會(huì)表現(xiàn)出芽變的多效性。與母株相比，芽變材料在植株形態(tài)、果個(gè)大小、果皮色澤等方面發(fā)生一定程度變異。本研究中的‘國光芽變材料在平均單果重、果實(shí)大小、可溶性固性物含量和果面著色指數(shù)均極顯著高于對(duì)照;使用AFLP分子標(biāo)記方法發(fā)現(xiàn)了芽變材料與對(duì)照間的差異片段，表明‘國光芽變材料確實(shí)發(fā)生了遺傳物質(zhì)的改變。

通常在AFLP分析中，每一條擴(kuò)增條帶對(duì)應(yīng)著DNA分子上的一個(gè)位點(diǎn)，不同引物擴(kuò)增帶的帶型、數(shù)量和分布均勻程度有著比較大的差異，區(qū)分能力也不同[10]。如AFLP對(duì)蘋果砧木基因型分析中，P32/M64引物擴(kuò)增效率高，圖譜質(zhì)量好，條帶清晰[11];對(duì)柑橘的遺傳分析中，發(fā)現(xiàn)9對(duì)引物多態(tài)性高，分辨能力強(qiáng)[12]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)相似情況， 4對(duì)引物在芽變材料和母株中共擴(kuò)增出283條條帶，出現(xiàn)65條多態(tài)性條帶，即檢測到283個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，65個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性條帶比率達(dá)到37.36%。引物組合E75/M54多態(tài)性比率高達(dá)71.79%，而E45/M65僅有5.08%。由此可見，引物組合E75/M54在‘國光品種芽變材料的區(qū)分上分辨率高、多態(tài)性強(qiáng)，對(duì)標(biāo)記‘國光蘋果農(nóng)藝性狀具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

參 考 文 獻(xiàn)：

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收稿日期：2019-05-27

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017CXGC0210）;國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（CARS-28）

作者簡介：聶佩顯（1982—），男，山東濰坊人，助理研究員，研究方向：蘋果栽培生理及果實(shí)品質(zhì)調(diào)控。E-mail：nieguan2008@163.com

通訊作者：王金政（1959—），男，山東濰坊人，研究員，研究方向：果樹遺傳育種與設(shè)施栽培。E-mail： wjz992001@163.com