程凱麗，胡志和*，張秋月，季 鈺，王 帥，吳偉捷，趙旭飛，賈凌云

（天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

乳糖是以單體分子形式存在于乳中的唯一雙糖，經(jīng)乳腺內(nèi)乳糖合成酶作用產(chǎn)生[1]。乳糖攝入后需要乳糖酶將其分解成單糖后才可以被吸收。由于腸道缺少乳糖酶，常引發(fā)乳糖不耐受。其最常見的癥狀為腹瀉，如不引起重視可導(dǎo)致營養(yǎng)不良、貧血、骨質(zhì)疏松等疾病[2-3]。

降低牛奶中乳糖的方法主要有物理法（主要是膜分離技術(shù)）[4]、生物法（酶法和微生物發(fā)酵法）[5-8]、基因工程法[9]。利用乳糖酶水解降低乳中乳糖含量是常用的方法。乳糖酶在動植物和微生物中分布廣泛，微生物來源主要有大腸桿菌、乳酸桿菌、酵母菌和霉菌等，多數(shù)乳糖酶都采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)[10-12]。源于微生物的乳糖酶，研究較多的是米曲霉和克魯維酵母[13-14]。岳壽松等[15]對馬克斯克魯維酵母菌所產(chǎn)乳糖酶酶學(xué)性能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該酶最適反應(yīng)溫度和pH值分別為47 ℃和7.0；侯重文等[16]對重組米曲霉乳糖酶和原米曲霉乳糖酶酶學(xué)性對照，證明重組酶與對照酶的最適反應(yīng)溫度相同，雖然pH穩(wěn)定性相差不大，但重組酶的熱穩(wěn)定要明顯優(yōu)于對照酶。

牛乳營養(yǎng)豐富，含有多種生物活性成分，是人類天然的保健食品[17]。同時，牛乳中的各種活性成分為不同類型功能性食品的開發(fā)提供了極好的天然原料來源[18]。但受乳糖不耐的影響，牛乳資源的利用受到限制。開發(fā)低乳糖或無乳糖的乳制品，對解決乳糖不耐受群體對乳的消費，以及開拓乳品市場非常必要。本研究對不同微生物來源的乳糖酶的水解特性進(jìn)行研究，并應(yīng)用于無乳糖原料奶制備，以期為無乳糖乳制品生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳和乳糖酶A、B、C 天津海河乳業(yè)有限公司；鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（o-nitrophenol β-D-galactoside，ONPG） 北京Biotopped科學(xué)技術(shù)有限公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

U-5100紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Bayer LactoMonitor乳糖檢測儀 美國拜安捷公司；VELP旋渦振蕩器 德祥科技有限公司；DK-420型電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Heracles II電子鼻 法國Alpha M.O.S公司；ME2002電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SDS-PAGE檢測乳糖酶成分及分子質(zhì)量

選擇十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）的方法檢測不同乳糖酶成分及分子質(zhì)量，選用濃縮膠和分離膠分別為5%和12%，考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色。

1.3.2 乳糖酶等電點的測定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[19]測定乳糖酶等電點。具體方法為：將3 種不同的乳糖酶分別稱取11等份置于50 mL離心管中，加入適量的去離子水；然后分別將粗酶液pH值調(diào)至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，4 000 r/min離心20 min，分別取0.6 mL樣品上清液于試管中，加入5.0 mL的考馬斯亮藍(lán)溶液及0.4 mL去離子水，混合后靜置3 min。取上清液在595 nm波長處測吸光度。

1.3.3 乳糖酶活力的測定

采用ONPG法測定乳糖酶活力，中性乳糖酶活力參照文獻(xiàn)[20]中的方法進(jìn)行測定；酸性乳糖酶活力測定參照文獻(xiàn)[21]方法，并做適當(dāng)調(diào)整。

樣品的制備：稱量適量樣品，精確至毫克，用反應(yīng)緩沖液溶解后，轉(zhuǎn)移至合適容量瓶中并定容，使得最后的溶液中含有0.027～0.095 U的酶活力。取0.5 mL稀釋后的實驗液，在42 ℃水浴10 min，加入已預(yù)熱至42 ℃的ONPG溶液2 mL，42 ℃水浴15 min后，快速加入2.5 mL 10% Na2CO3溶液，并渦旋管以停止酶反應(yīng)。反向添加ONPG底物和Na2CO3溶液作為空白，其余步驟與樣品相同。30 min內(nèi)，在420 nm波長處檢測樣品和空白液的吸光度。

1.3.4 不同條件對乳糖酶活力的影響

1.3.4.1 溫度對乳糖酶活力的影響

分別在5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 ℃的反應(yīng)溫度下測定乳糖酶活力。酶活力測定過程中每個測試樣各取3 份做平行檢測，取平均值（以下實驗平行處理方式相同）。

1.3.4.2 pH值對乳糖酶活力的影響

在同一溫度下，按1.3.3節(jié)酶活力測定方法，測定pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0條件下酶活力。

1.3.5 不同溫度下儲存原料奶揮發(fā)性成分分析

為確定酶解時間，分別將原料奶儲存在于4、6、8 ℃和10 ℃環(huán)境中，每小時取1 次樣，精確稱取7.0 g樣品，放入10 mL的頂空瓶中，加蓋密封后在Heracles II超快速氣相色譜電子鼻上進(jìn)行測定分析，采用AlphaSoft V 14.2進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。Heracles II電子鼻系統(tǒng)采用兩根并行不同極性的金屬毛細(xì)管色譜柱MXT-5和MXT-1701，升溫速率10 ℃/s，使用雙氫火焰離子化檢測器。采用正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液（n C6～n C16）進(jìn)行校準(zhǔn)，將保留時間轉(zhuǎn)化為保留指數(shù)，然后通過Aro Chem Base數(shù)據(jù)庫對化合物進(jìn)行定性分析。

實驗參數(shù)如下，頂空進(jìn)樣參數(shù)：加熱器孵化期20 min，孵化溫度50 ℃；進(jìn)樣量5 000 μL，進(jìn)樣口溫度200 ℃，注射時間45 s。捕集阱參數(shù)：捕集溫度40 ℃，分流10 mL/min，捕集時間50 s，最終溫度240 ℃。柱溫參數(shù)：初始溫度50 ℃，以1 ℃/s速率升溫至80 ℃，然后以3 ℃/s速率升溫至250 ℃；數(shù)據(jù)采集時間110 s。檢測器參數(shù)：檢測器溫度260 ℃。

1.3.6 無乳糖原料奶制備條件

1.3.6.1 低溫下加酶量對乳糖殘留量的影響

根據(jù)原料儲存溫度，水解溫度分別設(shè)置為4、6、8、10 ℃，酶A、B和C加酶量分別為2 000、3 000、4 000、5 000 U/kg和6 000 U/kg，分別于不同時間取樣測乳糖殘留量。

1.3.6.2 原料奶中乳糖殘留量的檢測

使用乳糖檢測儀，根據(jù)原料奶中含有的葡萄糖以及乳糖的含量計算出液態(tài)奶中乳糖殘留量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個處理設(shè)置3 個重復(fù)，結(jié)果取平均值，用Origin 95c作圖，用電子鼻自帶軟件Alpha Soft V14.2進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳糖酶酶學(xué)特性比較

2.1.1 乳糖酶SDS-PAGE分析

3 種乳糖酶的SDS-PAGE結(jié)果見圖1。經(jīng)計算，乳糖酶B和C的分子質(zhì)量約為130 kDa；乳糖酶A的分子質(zhì)量分別約為38 kDa和55 kDa。因此，乳糖酶A含有兩種成分。

圖1 乳糖酶的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE profiles of lactases derived from different sources

2.1.2 乳糖酶的等電點分析

將乳糖酶溶液調(diào)整至不同pH值、離心，取上清液，檢測其溶解情況，進(jìn)而確定其等電點。由圖2可知，乳糖酶A有兩個等電點，分別為4.0和5.0，這與電泳結(jié)果（圖1）相符；乳糖酶B等電點為5.0；乳糖酶C等電點為3.0。雖然乳糖酶B和C的電泳結(jié)果（圖1）顯示具有相同的分子質(zhì)量，但其等電點不同，因此，乳糖酶B和C是不同來源的乳糖酶。

圖2 pH值對乳糖酶溶解性能的影響Fig. 2 Effects of pH on lactase solubility

2.1.3 乳糖酶活力測定

2.1.3.1 ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線及3 種酶活力檢測

將不同濃度的ONP溶液在波長420 nm處測定吸光度，以O(shè)NP濃度為橫坐標(biāo)，以波長420 nm處吸光度為縱坐標(biāo)制作ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得擬合方程：Y=4.576 8X＋0.007 3，R2=0.999。按照酶活力定義[20-21]為一個中性乳糖酶單位（U）定義為在實驗條件下以1.30 μmol/min的速率釋放鄰硝基苯酚的酶量；一個酸性乳糖酶單位（U）定義為在測定條件下以1 μmol/min的速率釋放鄰硝基苯酚的酶量。計算乳糖酶A、B和C的酶活力分別為6 341、9 469、15 039 U/g。

2.1.3.2 溫度對乳糖酶活力的影響

圖3 溫度對酶活力的影響Fig. 3 Effect of temperature on lactase activity

如圖3所示，酶A、酶B和酶C最適反應(yīng)溫度分別為40、35 ℃和45 ℃，因為溫度是影響酶活性的主要因素之一，通常情況下各種酶都會有其最適作用溫度，在此溫度下酶的活力最高。如果溫度太高會影響酶蛋白的次級鍵，使蛋白質(zhì)變性，降低其酶活性；溫度過低，不利于酶的反應(yīng)進(jìn)程[22]。因此，溫度過高或過低，酶活都有一定程度的降低。廠家提供數(shù)據(jù)顯示酶A最適溫度為37～40 ℃，酶B和酶C最適溫度為38～40 ℃。因此，測定結(jié)果與廠家提供略有差異。

2.1.3.3 pH值對乳糖酶活力的影響

在不同pH值條件下，檢測乳糖酶活力，其活力變化見圖4。酶A和酶B趨勢基本一致，在pH 6.5時到達(dá)最高值；而酶C在pH 5.0時酶活性最高。在實驗范圍內(nèi)，酶活力隨著pH值的增大而逐漸增強；但當(dāng)pH值繼續(xù)增加時，酶活力開始呈下降趨勢。由于pH值對乳糖酶的活性有重要影響，在一定的pH值范圍內(nèi)，酶表現(xiàn)出較高的活性，pH值過高或過低都會影響酶的構(gòu)象，從而影響酶與底物的結(jié)合能力，導(dǎo)致酶活降低[23]。廠家提供酶A、酶B和酶C最適pH值分別為6.5、6.5和5.0，研究結(jié)果均與3 個廠家提供信息一致；酶A和B為中性乳糖酶，酶C為酸性乳糖酶。因此，通過電泳、等電點分析，以及不同溫度和pH值下酶活力的變化，3 種酶的性質(zhì)不同，可能來自不同的微生物。根據(jù)3 種乳糖酶的性質(zhì)不同，在制備無乳糖原料奶過程中，可采用中性乳糖酶A和B。

圖4 pH值對乳糖酶活力的影響Fig. 4 Effect of pH on lactase activity

2.2 低溫儲存對原料奶氣味的影響

采用電子鼻對儲存期間原料奶氣味變化進(jìn)行分析，確定不同溫度下儲存時間，進(jìn)而為不同溫度下乳糖酶水解乳糖，制備無乳糖原料奶提供時間參數(shù)。

2.2.1 不同溫度儲存原料奶的主成分分析

根據(jù)Alpha MOS電子鼻數(shù)據(jù)分析規(guī)則，若主成分分析累計貢獻(xiàn)率達(dá)到95%以上，且識別指數(shù)大于80，即可證明樣品間具有顯著性差異。由圖5可知，4、6、8 ℃和10 ℃主成分分析，其主成分1和2的累計貢獻(xiàn)率分別為60.274%、57.393%、53.852%、64.448%，均未達(dá)到80%；且識別指數(shù)分別為-172、-36、-178和-162，均未達(dá)到80，說明在4、6、8 ℃和10 ℃儲存12 h無法區(qū)別原料奶中氣味成分的變化，因此，在4～10 ℃范圍內(nèi)，原料奶儲存12 h無顯著變化。

圖5 不同儲存溫度下的原料奶主成分分析Fig. 5 Principal component analysis of raw milk stored at different temperatures for different durations

2.2.2 不同溫度儲存原料奶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

利用電子鼻對原料奶在4、6、8 ℃和10 ℃條件下儲存不同時間產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析，表1～4顯示，原料奶主要揮發(fā)性物質(zhì)包括：丙酮、2,3-丁二酮、2-丁酮、乙醛、月桂酸甲酯、甲硫醇、1-十九碳烯、1-壬烯-3-酮、二甲基硫醚、1-辛烯、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙?；?2-噻唑啉、乙酸等，在檢出的化合物中，酮類物質(zhì)最豐富。本實驗的檢測結(jié)果與韓清波等[24]報道結(jié)果一致。各物質(zhì)間共同作用構(gòu)成原料奶的揮發(fā)性風(fēng)味，隨著儲存時間的延長，各類揮發(fā)性物質(zhì)比例發(fā)生變化，乙酸、2,3-丁二酮、2-丁酮、2-乙基-6-甲基吡嗪、吲哚出現(xiàn)下降趨勢，但整體無顯著性差異。乙酸具有淡淡的酸味[25]，是牛奶中的主要揮發(fā)性成分之一，不同溫度下儲存比例略有變化，但變化幅度不大；酮類物質(zhì)多由不飽和脂肪酸的氧化、熱降解或微生物代謝產(chǎn)生，由于溫度較低，微生物代謝受抑制。因此，酮類略下降，但無顯著性差異[26-28]。丙酮、2-壬酮、乙醛、月桂酸甲酯、甲硫醇、1-十九碳烯總體呈現(xiàn)上升趨勢，整體也無顯著性差異。醇類化合物主要來自脂肪氧化和氨基酸分解，有文獻(xiàn)報道飽和醇的風(fēng)味閾值較高，對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，不飽和醇的風(fēng)味閾值較低，對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[29]；2-壬酮具有果香、甜香、青香及椰子、奶油的氣味；隨著儲存時間的延長，微生物可分解原料奶中的糖類，在各種酶參與下經(jīng)過一系列催化反應(yīng)，可生成醛類，醛類又可進(jìn)一步生成醇類，酸與醇發(fā)生反應(yīng)生成酯類。因此，月桂酸甲酯出現(xiàn)小幅度增長；含硫氨基酸主要是指半胱氨酸和蛋氨酸，硫醇來自牛乳中含硫氨基酸的分解[30-31]，是一種具有明顯風(fēng)味的揮發(fā)性含硫化合物。儲存過程中二甲基硫無明顯變化，較為平穩(wěn)，二甲基硫化物是新鮮牛奶的重要香氣成分[32]，微量的二甲基硫是牛奶風(fēng)味的主體，且在儲存的每一個階段均可檢出，但未能找到其風(fēng)味閾值，故未能對原料奶儲存過程中風(fēng)味貢獻(xiàn)大小進(jìn)行評價[33]。

表1 4 ℃儲藏條件下原料奶中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 1 Analysis of volatile flavor compounds in raw milk stored at 4 ℃

表2 6 ℃儲藏條件下原料奶中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 2 Analysis of volatile flavor compounds in raw milk stored at 6 ℃

表3 8 ℃儲藏條件下原料奶中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 3 Analysis of volatile flavor compounds in raw milk stored at 8 ℃

續(xù)表3

表4 10 ℃儲藏條件下原料奶中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 4 Analysis of volatile flavor compounds in raw milk stored at 10 ℃

2.3 低溫下乳糖酶添加量對原料奶中乳糖水解效果的影響

乳糖水解率是衡量乳糖水解程度的一個重要指標(biāo)[34]，根據(jù)2.2.1節(jié)的檢測結(jié)果，低溫下儲存12 h，原料奶氣味無顯著性差異。不同量的乳糖酶A對乳糖水解結(jié)果如圖6所示，原料奶乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%，在4 ℃條件下，當(dāng)酶添加量為2 000 U/kg時，乳糖水解速率較慢，水解12 h，乳糖殘留量仍不到無乳糖牛奶標(biāo)準(zhǔn)（即乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.5%），隨著溫度的升高，相同加酶量下，乳糖水解效率提高，8 ℃和10 ℃分別在11 h和10 h降到0.5%以下；當(dāng)酶添加量為3 000 U/kg時，不同儲存溫度，均可在12 h內(nèi)達(dá)到無乳糖牛奶標(biāo)準(zhǔn)。同時，隨著加酶量的增加，水解效率明顯加快，10 ℃加酶量為6 000 U/kg時，3 h即可水解到無乳糖牛奶標(biāo)準(zhǔn)水平。伍桃英等[35]研究證明，加酶量相同，乳糖水解率與水解時間呈正相關(guān)；相同溫度下，乳糖水解率隨著加酶量的增加而增大。

在實際生產(chǎn)中，原料奶的儲存溫度在4～8 ℃之間，儲存時間一般在5～6 h之間。在此時間內(nèi)，4 ℃和6 ℃條件下，酶A添加量為6 000 U/kg；在8 ℃和10 ℃條件下，酶A添加量為4 000 U/kg，其乳糖含量即可降至無乳糖牛奶的水平。

圖6 添加不同量的乳糖酶A對原料奶中乳糖殘留量的影響Fig. 6 Effect of adding different amounts of lactase A on lactose residue in raw milk

在4～10 ℃添加不同量乳糖酶B，乳糖水解效果見圖7。乳糖殘留量降低趨勢與圖6基本相同。與酶A相比，酶B的水解效率較低，在4、6 ℃和8 ℃條件下，2 000 U/kg的加酶量乳糖均未在12 h內(nèi)降至無乳糖牛奶水平；在10 ℃條件下，11 h時乳糖殘留量才能夠降至0.49%，達(dá)到無乳糖牛奶標(biāo)準(zhǔn)。因此，在實驗溫度范圍內(nèi)，溫度越高，乳糖水解速度越快。低溫下，0～1 h乳糖殘留量降低幅度很大，1 h后降低速率減慢，這可能是隨水解時間的延長，乳糖水解成葡萄糖的量增加，導(dǎo)致水解效率下降[36]，馮永強等[37]研究無乳糖酸乳的制備時證實了乳糖酶的添加量對乳糖殘留影響較大。因在實際生產(chǎn)中原料奶儲存時間一般在5～6 h之間，8 ℃和10 ℃儲存時均可選擇5 000 U/kg和6 000 U/kg的乳糖酶添加量。

圖7 添加不同量的乳糖酶B對原料奶中乳糖殘留量的影響Fig. 7 Effect of adding different amounts of enzyme B on lactose residue in raw milk

3 結(jié) 論

經(jīng)檢測，3 種乳糖酶中，酶A和酶B為中性乳糖酶（酶活力的最適pH值為6.5），酶C為酸性乳糖酶（酶活力的最適pH值為5.0），且3 種乳糖酶來自不同微生物。在無乳糖原料奶生產(chǎn)中，應(yīng)用中性乳糖酶A和酶B較好。電子鼻結(jié)果表明，原料奶低溫儲存12 h風(fēng)味上無顯著性差異；在該時間范圍內(nèi)，4～8 ℃條件下，原料奶中添加乳糖酶A或酶B，添加量6 000 U/kg，可將原料奶乳糖含量降至無乳糖水平（小于0.5%），且能夠保證原料奶質(zhì)量；另外，乳糖酶A的降解原料奶中乳糖的效率更好。