韓 經(jīng)，張華東，許忠平，任 雪，魏曉慶，肖冬光*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

酯酶也稱羧基酯酶，指能夠水解羧酯鍵的酶類，功能與脂肪酶類似，在酶學(xué)上并無酯化酶這一術(shù)語，由于該酶具有合成與分解酯類的催化作用，因此在白酒行業(yè)內(nèi)通常稱之為酯化酶和酯分解酶[1-2]。

在自然界中能產(chǎn)生酯酶的微生物是非常豐富的，其中霉菌作為白酒中重要的產(chǎn)酯微生物[3-5]，其分泌的酯化酶能催化乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸和酵母酒精發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇酯化合成乳酸乙酯。乳酸乙酯是白酒中重要的呈香成分[6]，對(duì)白酒品質(zhì)具有重要作用，乳酸乙酯含量高是我國白酒的顯著特征之一[7]，并且乳酸乙酯作為能與水和乙醇互溶的唯一的乙酯類，在水味重酒味淡薄的酒中，還能消除酒的水味，增加濃厚感[8]。當(dāng)今研究發(fā)現(xiàn)在白酒生產(chǎn)中中乳酸乙酯的合成相較于酶催化，主要以化學(xué)合成為主[9-10]，并其合成速度非常緩慢。而近年來隨著清潔化生產(chǎn)的推進(jìn)[11]，出現(xiàn)了基酒中乳酸乙酯含量不足的問題，因此需要迫切尋找一種白酒專用高產(chǎn)乳酸乙酯酯化酶菌株應(yīng)用于白酒生產(chǎn)中，提高白酒的質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。目前國內(nèi)對(duì)于產(chǎn)乳酸乙酯酯化酶菌株的研究較少，大多數(shù)還是通過一些常用的工業(yè)菌株紅曲霉，根霉進(jìn)行研究[12-14]，相反對(duì)于己酸乙酯酯化酶的研究很多[15]，并將其廣泛應(yīng)用于濃香型白酒的增香與調(diào)味酒中[16]。

常壓室溫等離子體（atmospheric pressure room temperature plasma，ARTP）作為一種操作簡便，對(duì)人與環(huán)境均無害，突變率高的誘變技術(shù)[17]，已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、霉菌、酵母、放線菌等微生物的誘變育種[18-20]，均取得較好成果。有文獻(xiàn)報(bào)道，ARTP誘變成功篩選出一株高產(chǎn)己酸乙酯酯化酶的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[21]，但國內(nèi)外對(duì)于乳酸乙酯酯化酶菌株的篩選和誘變研究較少，并且酯化酶篩選存在對(duì)底物專一性不足的問題。因此，本研究通過對(duì)多株霉菌乳酸乙酯合成量的比較，通過常壓室溫等離子體誘變，并采用多級(jí)篩選體系，篩選出一株酶活明顯提高的突變株，應(yīng)用于白酒的生產(chǎn)，旨在提升白酒品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 化學(xué)試劑

乳酸、乙醇（均為分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；三丁酸甘油酯（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 菌種

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）M16、煙色紅曲霉（Aspergillus fumigatus）M6、根霉（Rhizopus）Q303、華根霉（Rhizopus chinensis）R3、米曲霉（Aspergillus oryzae）A12、黑曲霉（Aspergillus niger）T103：由天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

一級(jí)平板篩選培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基：土豆200 g（去皮），葡萄糖20 g，瓊脂25 g，蒸餾水1 000 mL；乳化液：將19 mL 3%的聚乙烯醇溶液與1 mL三丁酸甘油酯充分混合；將PDA固體培養(yǎng)基和乳化液按4∶1的體積比混合，pH自然。121 ℃滅菌20 min。

PDA液體培養(yǎng)基：土豆200 g（去皮），葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。主要用于菌種活化和誘變前菌種萌發(fā)。

PDA固體斜面培養(yǎng)基：土豆200 g（去皮），葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。主要用于突變株的保藏。

麩曲固體培養(yǎng)基：

①試管培養(yǎng)（一級(jí)種）：稱取一定量的麩皮，加水65%左右，拌勻后分裝試管，厚度為2.0 cm，121 ℃滅菌20 min。

②三角瓶培養(yǎng)（二級(jí)種）：稱取一定量的麩皮，加水80%，充分拌勻，裝入500 mL三角瓶內(nèi)，厚度為2.0 cm，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

EL20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：梅特勒儀器（上海）有限公司；DHP恒溫培養(yǎng)箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；BXW-360SD-G立式壓力滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；TS-2402CL恒溫?fù)u床：上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Agilent 7890B氣相色譜儀：美國安捷倫科技公司；ARTP-IIS常壓室溫等離子誘變儀：北京思清源生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 純種麩曲的培養(yǎng)

將滅菌的一級(jí)麩曲試管接種煙色紅曲霉M6、紫色紅曲霉M16、Q303根霉、華根霉R3、米曲霉A12、黑曲霉T103孢子，置于30 ℃培養(yǎng)48 h，菌絲體遍布麩皮，置于37 ℃培養(yǎng)箱烘干，振蕩打散即為一級(jí)種子。待冷卻后將一級(jí)種子接入三角瓶麩皮培養(yǎng)基中，充分搖勻，30 ℃培養(yǎng)40 h，待菌絲體布滿并將麩皮連成餅狀時(shí)進(jìn)行扣瓶，使麩皮脫離底部繼續(xù)培養(yǎng)1 d，即可出瓶。出瓶后置于牛皮袋內(nèi)，于37～40 ℃快速烘干（含水量＜12%），充分打散并保存。

1.3.2 乳酸乙酯酯合成量的測(cè)定

吸取1 mL乳酸和20 mL無水乙醇于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻后轉(zhuǎn)入250 mL玻璃瓶中，加5 g烘干曲粉，于30 ℃保溫酯化7 d。然后加入50 mL 蒸餾水于1 000 mL 蒸餾燒瓶中加熱蒸餾，并接收餾出液100 mL。取酯化餾出液進(jìn)行氣相色譜分析，其色譜檢測(cè)條件如下：Agilent HP-INNOWAX色譜柱（30 m×320 μm×0.25 μm）；載氣為高純氮?dú)猓∟2）（純度＞99.999%）；柱流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣口溫度200 ℃；檢測(cè)器溫度200 ℃；程序升溫：起始溫度50 ℃，保持8 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持15 min；進(jìn)樣體積為1 μL；分流進(jìn)樣，分流比為10∶1。

1.3.3 出發(fā)菌株的選擇

（1）不同菌種麩曲催化合成乳酸乙酯含量的比較

按照1.3.1的方法，實(shí)驗(yàn)組將煙色紅曲霉M6、紫色紅曲霉M16、Q303根霉、華根霉R3、米曲霉A12、黑曲霉T103分別培養(yǎng)制成麩曲，并以不添加曲粉的反應(yīng)體系為對(duì)照組，且將對(duì)照組的反應(yīng)條件與實(shí)驗(yàn)組調(diào)成一致。每組實(shí)驗(yàn)做3次平行，按1.3.2的方法測(cè)定乳酸乙酯合成量，比較各菌株所產(chǎn)酯化酶對(duì)合成乳酸乙酯的能力，并初步挑選產(chǎn)乳酸乙酯酯化酶菌株以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（2）pH對(duì)酯化酶催化合成乳酸乙酯含量的影響

在pH值2.5～5.0的范圍內(nèi)，以pH值0.5為一個(gè)梯度，共設(shè)6個(gè)梯度，實(shí)驗(yàn)組分別在各pH值下測(cè)定酯化酶對(duì)乳酸乙酯合成量的大小，并以不添加曲粉的反應(yīng)體系為對(duì)照組，保持酯化力測(cè)定中的溫度和其他條件不變。每組實(shí)驗(yàn)做3次平行，按1.3.2的方法測(cè)定乳酸乙酯合成量。以此來確定酯化酶的最適酯化pH值。

（3）溫度對(duì)酯化酶催化合成乳酸乙酯含量的影響

在溫度值20～45 ℃的范圍內(nèi)，以溫度值5 ℃為一個(gè)梯度，共設(shè)6個(gè)梯度，實(shí)驗(yàn)組分別在各溫度下測(cè)定酯化酶對(duì)乳酸乙酯合成量的大小，并以不添加曲粉的反應(yīng)體系作為對(duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)做3次平行，按1.3.2的方法測(cè)定乳酸乙酯合成量。以此確定酯化酶的最適酯化溫度。

1.3.4 篩選方法的建立

（1）一級(jí)篩選

利用菌株產(chǎn)生的酯酶分解三丁酸甘油酯產(chǎn)生脂肪酸和甘油，從而形成透明圈的原理。將經(jīng)過常壓室溫等離子體（ARTP）誘變的孢子菌懸液稀釋涂布于一級(jí)篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)5 d。挑選產(chǎn)透明圈大的單菌落接種于PDA斜面培養(yǎng)基，4 ℃保藏，以產(chǎn)生的透明圈的大小來衡量菌株產(chǎn)酯酶能力的高低。

（2）二級(jí)篩選

為了篩選的便捷并且更加準(zhǔn)確地衡量產(chǎn)乳酸乙酯酯化酶的能力，將一級(jí)篩選得到的透明圈直徑D與菌落直徑d的比值較大的菌株接種于裝有PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在100 mL水相體系中，以80 mL土豆液體培養(yǎng)基為基質(zhì)，添加2%玉米粉為碳源，1%的豆粕為氮源，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)72 h制備酯化酶液[22]，為節(jié)約篩選時(shí)間并能測(cè)定突變株的最佳酶活，調(diào)pH為3.5，靜置酯化4 d，測(cè)定乳酸乙酯合成量。

（3）三級(jí)篩選

將二級(jí)篩選得到的產(chǎn)乳酸乙酯較高的菌株按1.3.1的方法制成麩曲，調(diào)pH為3.5，進(jìn)行乳酸乙酯合成量測(cè)定。

1.3.5 ARTP菌種誘變

（1）孢子懸液的制備

將菌株接入PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h，然后用5 mL滅菌的生理鹽水洗下孢子，置于裝有玻璃珠的PDA液體培養(yǎng)基中，充分打散，并在30 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 h使菌株孢子萌發(fā)[23]，然后用無菌脫脂棉過濾即得孢子菌懸液。調(diào)整孢子懸液濃度為105～106個(gè)/mL。

（2）ARTP誘變過程

利用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變儀對(duì)菌種進(jìn)行誘變。誘變時(shí)的工作氣體為氦氣。按照處理功率100 W，氦氣流量12 L/min，樣品與等離子體發(fā)生器出口距離2 mm，操作溫度在25～35 ℃，每個(gè)金屬載片上均勻涂布10 μL的孢子菌懸液，分別按30、60、90、120、150、180、210、240、270 s不同的誘變照射時(shí)間來處理孢子懸浮液，誘變后將金屬載片置于裝有1 mL無菌生理鹽水的EP管中，振蕩懸浮，每個(gè)處理時(shí)間分別做10-1、10-2、10-3三個(gè)稀釋度進(jìn)行涂板，每個(gè)稀釋度涂3個(gè)平板，30 ℃培養(yǎng)5 d后進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過菌落形成單位（colony-forming units，CFU）來計(jì)算致死率、正突變率，其計(jì)算公式如下：

式中：正突變菌落數(shù)為透明圈直徑大于出發(fā)菌株透明圈直徑的菌落數(shù)。

（3）最佳誘變時(shí)間的選擇

通過CFU平板菌落計(jì)數(shù)法繪制菌株誘變后的致死率、正突變率曲線。對(duì)曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以正突變率最高的時(shí)間點(diǎn)作為最佳誘變時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)誘變處理。

（4）遺傳穩(wěn)定性分析

連續(xù)傳代5代，按1.3.1的方法制成麩曲，對(duì)誘變篩選得到的突變株黑曲霉T206進(jìn)行乳酸乙酯酯化能力的測(cè)定，考察誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株的選擇

2.1.1 不同菌種麩曲乳酸乙酯合成量的比較

通過將實(shí)驗(yàn)室篩選保存的煙色紅曲霉M6，紫色紅曲霉M16，根霉Q303，華根霉R3，米曲霉SQ12，黑曲霉T103固體培養(yǎng)分別制成麩曲，30 ℃靜置酯化7 d，蒸餾測(cè)定各霉菌麩曲催化合成乳酸乙酯的能力，結(jié)果見圖1。

圖1 不同菌株麩曲的乳酸乙酯酯化力比較Fig.1 Comparison of ethyl lactate esterification power of different Fuqu

由圖1可知，在催化合成乳酸乙酯的酯化能力上來看，米曲霉A12達(dá)到250.15 mg/L，煙色紅曲霉M6達(dá)到180.35 mg/L，Q303根霉達(dá)到85.75 mg/L，華根霉R3達(dá)到58.75 mg/L，紫色紅曲霉M16達(dá)到289.15 mg/L，均低于空白對(duì)照（化學(xué)合成）的315.28 mg/L，說明其對(duì)催化合成乳酸乙酯幾乎沒有作用，甚至起到了酯分解酶的作用，只有黑曲霉T103對(duì)乳酸乙酯的合成量最高，達(dá)到了601.75 mg/L。因此，初步選擇黑曲霉T103為出發(fā)菌株，并進(jìn)一步探究其所產(chǎn)酯化酶最適酯化pH和最適酯化溫度。

2.1.2 pH對(duì)黑曲酯化酶合成乳酸乙酯的影響

圖2 pH值對(duì)黑曲霉T103酯化酶合成乳酸乙酯的影響Fig.2 Effect of pH on the synthesis of ethyl lactate by esterase from Aspergillus niger T103

由圖2可知，pH值對(duì)黑曲酯化酶酯化乳酸乙酯有很大影響，隨著pH值的上升，化學(xué)作用合成乳酸乙酯的量逐漸減少，當(dāng)pH值＜3.5時(shí)，酶作用合成乳酸乙酯的量隨著pH的升高而逐漸增加，當(dāng)pH值達(dá)到3.5時(shí)，此時(shí)酶作用酯化乳酸乙酯的量最大，達(dá)到602.37 mg/L，當(dāng)pH值大于3.5時(shí)，酶作用隨著pH的升高而下降，因此黑曲酯化酶催化合成乳酸乙酯的最適pH值為3.5。

2.1.3 溫度對(duì)黑曲酯化酶合成乳酸乙酯的影響

表1 溫度對(duì)黑曲霉T103酯化酶合成乳酸乙酯的影響Table 1 Effect of temperature on the synthesis of ethyl lactate by esterase from Aspergillus niger T103 mg/L

由表1可知，隨著溫度的上升，分子的熱運(yùn)動(dòng)速率加快，乳酸乙酯的化學(xué)合成量是一直增加的，當(dāng)溫度在20～30 ℃時(shí)，黑曲霉作用酯合成量＞化學(xué)作用酯合成量，說明黑曲酶作用合成乳酸乙酯占有主導(dǎo)作用，在溫度20 ℃時(shí)，酶作用酯化能力最強(qiáng)，達(dá)到327.59 mg/L，隨著溫度的上升，酶酯化作用越來越弱，化學(xué)作用越來越強(qiáng)，當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，高溫使黑曲酯化酶變性失活，因而黑曲酯化酶對(duì)乳酸乙酯的酯化幾乎沒有作用。而當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，此時(shí)綜合作用酯化乳酸乙酯的量最高，達(dá)到601.98 mg/L。因此，黑曲酯化酶催化合成乳酸乙酯的最適溫度為30 ℃。

2.1.4 出發(fā)菌株的確定

通過對(duì)6株霉菌產(chǎn)酯化酶合成乳酸乙酯能力的比較，其中黑曲霉T103對(duì)乳酸乙酯具有合成作用，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其最適酯化pH為3.5，最適酯化溫度為30 ℃，符合白酒發(fā)酵的基礎(chǔ)條件，因此確定黑曲霉T103為出發(fā)菌株以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 誘變菌株的篩選

2.2.1 ARTP誘變致死率和正突變率曲線的測(cè)定

對(duì)黑曲霉的孢子進(jìn)行前培養(yǎng)萌發(fā)后，進(jìn)行ARTP誘變處理，對(duì)黑曲霉T103誘變的致死率和正突變率進(jìn)行計(jì)算，并繪制致死率和正突變率曲線，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在60 s前致死率上升緩慢，但在90 s時(shí)致死率急劇上升至92%，隨后在120 s下降至84%，210 s以后上升至96%左右，隨著誘變時(shí)間的增加，270 s后致死率接近100%。為了盡可能多的選育出好的突變株，選擇致死率為70%～80%誘變平板中誘變菌株，并在120 s時(shí)正突變率較高。因此，確定誘變時(shí)間為120 s，進(jìn)行后續(xù)菌株選育。

圖3 誘變時(shí)間對(duì)黑曲霉T103致死率及正突變率的影響Fig.3 Effect of mutagenesis time on lethality and positive mutation rate of Aspergillus niger T103

2.2.2 菌株初篩

采用添加三丁酸甘油酯產(chǎn)透明圈的方法，通過對(duì)各突變株透明圈大小的比較，總共挑選100個(gè)透明圈有明顯的變化的菌株。

2.2.3 二級(jí)篩選

將初篩的100株菌進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)酯化酶，并按照二級(jí)篩選體系進(jìn)行乳酸乙酯合成量的測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 誘變黑曲霉菌株二級(jí)篩選結(jié)果Table 2 Secondary screening results of mutant Aspergillus niger

由表2可知，二級(jí)篩選體系中，出發(fā)菌株黑曲霉T103對(duì)乳酸乙酯合成量為430.15 mg/L，與出發(fā)菌株相比，發(fā)現(xiàn)有6株突變菌（No.7、No.15、No.39、No.52、No.75、No.92）對(duì)乳酸乙酯合成量在500 mg/L以上，其中菌株H7對(duì)乳酸乙酯的合成能力最高，達(dá)到530.18 mg/L。因此，選擇這6株突變菌（No.7、No.15、No.39、No.52、No.75、No.92）進(jìn)行三級(jí)篩選，確定其固態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)酯化酶催化合成乳酸乙酯能力的大小。

2.2.4 三級(jí)篩選

將二級(jí)篩選出的產(chǎn)酶能力提高的誘變菌株進(jìn)行麩曲固態(tài)培養(yǎng)，制成麩曲烘干并測(cè)定乳酸乙酯合成量，結(jié)果見圖4。

圖4 誘變黑曲霉菌株三級(jí)篩選結(jié)果Fig.4 Tertiary screening results of mutant Aspergillus niger

由圖4可知，6株突變菌（No.7、No.15、No.39、No.52、No.75、No.92）的乳酸乙酯合成量都有一定提高，其中菌株No.7（初步命名為黑曲霉T206）合成乳酸乙酯的量最高，達(dá)到892.15 mg/L，相較于出發(fā)菌株的727.88 mg/L提高了22.71%。

2.2.5 遺傳穩(wěn)定性研究

為了檢測(cè)誘變菌株產(chǎn)酯化酶能力的穩(wěn)定性，將其連續(xù)傳代5代，按酯化力的測(cè)定方法，測(cè)定其對(duì)乳酸乙酯的酯化能力，結(jié)果表明乳酸乙酯的合成量穩(wěn)定在880.58 mg/L左右，總體突變菌株黑曲霉T206具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

通過對(duì)6株霉菌（煙色紅曲霉M6，紫色紅曲霉M16，Q303根霉，華根霉R3，米曲霉A12，黑曲霉T103）進(jìn)行乳酸乙酯酯化能力的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)只有黑曲霉T103對(duì)乳酸乙酯的合成具有催化作用，并探究了黑曲霉T103酯化酶催化合成乳酸乙酯的最適pH值為3.5，最適溫度為30 ℃，符合白酒發(fā)酵的基礎(chǔ)條件，因此確定黑曲霉T103為出發(fā)菌株。進(jìn)一步采用ARTP誘變技術(shù)對(duì)其進(jìn)行誘變，結(jié)合透明圈法初篩、液體產(chǎn)酶的二級(jí)篩選及固態(tài)產(chǎn)酶的三級(jí)篩選，得到一株酶活較高的為突變株黑曲霉T206，其液態(tài)、固態(tài)產(chǎn)酶催化乳酸乙酯的合成量分別為530.18 mg/L、892.15 mg/L，相較于出發(fā)菌株黑曲霉T103分別提高了23.56%、22.71%。