劉 洋

（長春職業(yè)技術學院 食品與生物技術學院，吉林 長春 130033）

黑木耳（Auricularia auricula）別名云耳、樹耳，是一種藥食同源的食用菌。含有蛋白質、脂肪、碳水化合物和多種維生素與無機鹽，其中蛋白質的含量相當于肉類，維生素B2含量超過米、面、蔬菜和肉類，鐵的含量比肉類高100倍，鈣的含量是肉類的30～70倍，還含有磷和硫等構成人體細胞原生質的主要成分，因此被譽為“素中之葷”[1]。此外黑木耳中所含有的多種礦物質元素還能使體內的各種結石產生化學反應，使結石剝脫、瓦解，不斷脫屑縮小，然后再經管道排出[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)認為黑木耳有滋潤強壯、清肺益氣、補血活血、鎮(zhèn)靜止痛等功效[3]，現代醫(yī)學研究發(fā)現，黑木耳中含有多糖[4]、多酚[5]、黃酮[6]、黑色素[7]及膳食纖維[8]等活性成分，具有抗氧化[9]、抗腫瘤[10]、抑菌[11]、降血糖[12]、護肝[13]及預防動脈粥樣硬化[14]及抗血小板聚集、防止血栓形成[15]等多種生物活性，被人們稱為“食品阿司匹林”。

米酒含有豐富的維生素、葡萄糖、氨基酸等營養(yǎng)成分，能促進新陳代謝，具有補血養(yǎng)顏、舒筋活絡、強身健體和延年益壽的功效，是老幼均宜的營養(yǎng)佳品。

隨著人們生活水平的提高，對保健食品的需求越來越多，本研究擬將長白山優(yōu)質資源黑木耳與糯米進行綜合開發(fā)，利用糯米發(fā)酵中糖化酶及蛋白酶將黑木耳中的各種高分子物質體外酶解成人體易于吸收的寡糖、氨基酸等小分子營養(yǎng)物質，增強黑木耳的營養(yǎng)活性和生物利用度[16]，提高傳統(tǒng)米酒的營養(yǎng)價值及保健功效，為黑木耳的深精加工及功能性食品的開發(fā)提供新的途徑，增強黑木耳在國內及國際市場上的影響力，對于推介吉林省優(yōu)質特色資源、規(guī)劃黑木耳種植等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生山木耳：吉林省長白山地區(qū)；糯米：市售；甜酒曲：安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設備

LB50T手持糖度計：深圳市德優(yōu)平科技有限公司；SPM-808智能生化培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠；HH-8 型恒溫水浴鍋：蘇州江東精密儀器有限公司；Alcomat Super酒精度測試儀：意大利蓋博分析儀器公司；FA系列電子分析天平：天津市精拓儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑木耳米酒釀造工藝流程及操作要點

黑木耳干粉制備：挑選優(yōu)質干黑木耳于30～40 ℃水中浸泡50～60 min，加水量以淹沒黑木耳為宜，清洗干凈后將其撈出，加適量水后用組織搗碎機破碎，取出漿液用膠體磨進行細磨，用150、200目的兩層紗布過濾、置于105 ℃烘箱干燥24 h，得黑木耳干粉。

浸米、蒸煮、淋米、拌曲：糯米洗凈加水浸泡，米和水的料液比為1.0∶2.0（g∶mL），浸泡達米粒無白心，手捏即碎為宜。用水沖去白漿放入鍋內進行蒸飯，蒸煮約45 min后待米粒疏松，透明發(fā)亮后取出，用約20 ℃的涼水淋至室溫，將米飯置于缸內，加甜酒曲與黑木耳干粉后攪拌均勻，中央挖出一個倒喇叭狀的小孔，便于觀察產酒情況。

糖化發(fā)酵：26～34 ℃糖化發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)24～72 h結束發(fā)酵。

滅菌：將米酒用發(fā)酵罐密封加熱至75 ℃左右殺菌15～20 min，冷卻后即制黑木耳米酒。

1.3.2 單因素試驗方法

每次試驗投入300 g糯米，以感官評價為指標，分別考察黑木耳添加量（2%、4%、6%、8%、12%）、甜酒曲接種量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、發(fā)酵時間（32 h、40 h、48 h、56 h、64 h）4個因素對米酒理化指標及感官評分的影響。通過控制變量法進行單因素試驗，分別選取固定參數為黑木耳添加量8%，甜酒曲接種量1%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間48 h。

1.3.3 黑木耳米酒釀造工藝優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，利用Design Expert 8.0軟件進行Box-Behnken中心組合試驗設計，通過響應面法對黑木耳添加量（A）、甜酒曲接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）為考察因素，依據單因素試驗確定的中心值確定其試驗水平，以感官評分為響應值，得到最佳釀造工藝，響應面試驗因素與水平如表1[17-18]。

表1 黑木耳米酒釀造工藝條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for brewing technology optimization of Auricularia auricula rice wine

1.3.4 測定方法

感官評價方法：由食品營養(yǎng)與檢測專業(yè)12名學生組成感官評價小組，其中6男6女，參照農業(yè)行業(yè)標準NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》對評價小組成員進行專業(yè)培訓，產出成品當天即進行獨立品評賦分，樣品隨機編號，計算平均值。具體評價標準見表2[19-20]。

表2 黑木耳米酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standard of Auricularia auricula rice wine

酒精度：參照GB/T 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》；還原糖：參照GB/T 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》；總酸：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；氨基酸：參照GB5009.124—2016《食品中氨基酸的測定；菌落總數：參照GB/T 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》；大腸菌群：參照GB/T 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數》。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 黑木耳添加量對米酒品質的影響

由圖1可知，隨著黑木耳添加量的增加，黑木耳米酒感官評分呈現先升高后降低的趨勢，酒精度起初稍有升高，添加量＞6%時開始下降。黑木耳添加量較少時，米酒中黑木耳味道極淡，色澤較淺，有澀味，隨著黑木耳添加量的增加，米酒色澤逐漸變深呈褐色，口感爽滑，有黑木耳清香味道，酒體協(xié)調性好；黑木耳添加量為6%時，黑木耳米酒的感官評分達到了（89.1±1.5）分；黑木耳添加量超過6%時，由于黑木耳添加比例過大，相當于拌曲加水量減少，影響后續(xù)酵母發(fā)酵產酒精，酒精度下降，米酒風味下降，產品口感黏稠，有膩口感，酒體呈現微渾，協(xié)調性差。因此選擇黑木耳添加量為4%、6%、8%用于響應面優(yōu)化試驗。

圖1 黑木耳添加量對黑木耳米酒酒精度及感官評分的影響Fig.1 Effect of Auricularia auricula addition on alcohol content and sensory evaluation of A.auricula rice wine

2.1.2 甜酒曲接種量對米酒品質的影響

圖2 甜酒曲接種量對黑木耳米酒酒精度及感官評分的影響Fig.2 Effect of sweet Jiuqu inoculum on alcohol content and sensory evaluation of Auricularia auricula rice wine

由圖2可知，接種量為0.4～1.0%時，隨著甜酒曲接種量的增加，酒精度隨之增加，當接種量偏低時甜酒曲中根霉及酵母菌生長及糖化作用較低，原料不能完全發(fā)酵，導致米酒中酒精度偏低，酒香不突出，口感偏淡無味，隨著甜酒曲接種量增加，發(fā)酵速度加快，酒精度持續(xù)增加；當接種量為1.0%時，米酒香氣濃郁，口感爽滑細膩，味道協(xié)調柔和，此時感官評分最高為（90±1.4）分；而當接種量超過1.0%時，由于甜酒曲中根霉菌及酵母菌大量繁殖導致發(fā)酵體系急劇升溫，酵母菌中大量有害菌繁殖，引起酸敗現象，影響米酒澄清度，酒體風味變得酸澀、泛苦，感官評分隨之下降。因此，選擇甜酒曲接種量為0.8%、1.0%、1.2%用于響應面優(yōu)化試驗。

2.1.3 發(fā)酵溫度對米酒品質的影響

圖3 發(fā)酵溫度對黑木耳米酒酒精度及感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory evaluation of Auricularia auricula rice wine

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，米酒的酒精度呈現升高的趨勢，感官評分呈現先升高后下降的趨勢，當溫度較低時，甜酒曲中根霉及酵母菌的生長及糖化發(fā)酵作用較低，原料利用率低，酒體渾濁，米酒口感寡淡無味，當溫度達到30 ℃，酒曲中的根霉達到最適宜發(fā)酵溫度，根霉利用其淀粉酶活性可以將糯米淀粉及黑木耳中的高分子營養(yǎng)成分分解成單糖、低聚糖等，同時自身發(fā)酵產生乳酸等有機酸，形成黑木耳獨有的清香及米酒香氣，口感爽滑、柔和，黑木耳米酒的感官評分達到了（88±1.5）分；溫度高于30 ℃，容易滋生微生物，同時隨著發(fā)酵速度加快會產生一系列副產物導致酒體變渾濁，有異味產生，酒體不協(xié)調，黑木耳米酒的感官評分下降。因此選擇發(fā)酵溫度為28 ℃、30 ℃、32 ℃用于響應面優(yōu)化試驗。

2.1.4 發(fā)酵時間對米酒品質的影響

圖4 發(fā)酵時間對黑木耳米酒酒精度及感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content and sensory evaluation of Auricularia auricula rice wine

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間延長，黑木耳米酒感官評分呈現先升高后降低的趨勢，酒精度持續(xù)升高。發(fā)酵時間較短，則糖化不完全，發(fā)酵液中還原糖含量及酒精度均較低，風味不顯著；隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵液酒精中糖分不斷轉換成乙醇和香氣物質，導致感官評分分數偏高，黑木耳米酒的感官評分達到了（87±1.4）分；發(fā)酵時間超過48 h，酒精度明顯升高，同時產生大量乙酸，酒體中酸味較重，酒味大，米酒有強烈的苦澀味，口感差，黑木耳米酒的感官評分下降。因此選擇40 h、48 h、56 h用于響應面優(yōu)化試驗。

2.2 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，通過響應面試驗對黑木耳添加量（A）、甜酒曲接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）4個因素分析，試驗設計及結果見表3，方差分析見表4。

表3 黑木耳米酒釀造工藝條件優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface tests for brewing technology optimization of Auricularia auricula rice wine

表4 響應面試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface tests results

將試驗數據通過Design Expert 8.0軟件進行多元回歸擬合，得到4個因素的多元回歸方程：

由表4數據可知，模型P＜0.000 1（極顯著），失擬項P=0.285 6＞0.05（不顯著），說明試驗模型有較好的擬合性，相關系數R2=0.966 7和調整系數R2Adj=0.955 3也表明模型擬合程度較好。4.85%的變異系數（CV）說明模型的重現性很好?？梢岳没貧w方程確定黑木耳米酒釀造工藝條件。

顯著性檢驗表明，對黑木耳米酒感官評分影響次序為：C（發(fā)酵溫度）＞B（接種量）＞D（發(fā)酵時間）＞A（添加量），與表3的方差分析結果吻合。其中一次項B、C、D及交互項BD二次項A2、C2、D2對米酒感官評分的影響極顯著（P＜0.01）；一次項A及交互項AB、AC、AD對米酒感官評分的影響顯著（0.01＜P＜0.05）；其他因素對感官評分的影響不顯著（P＞0.05）。

圖5 黑木耳添加量、酒曲接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間交互作用對黑木耳米酒感官評分影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between Auricularia auricula addition,sweet Jiuqu inoculum,fermentation temperature and time on the sensory evaluation of A.auricula rice wine

由圖5可以直觀看出各因素的交互作用對米酒感官品質的影響，若曲線越陡峭則該因素對米酒感官評分的影響越大。由圖5可以看出發(fā)酵溫度（C）對米酒感官品質影響最大，甜酒曲接種量（B）次之，與表4的方差分析結果相吻合。

2.3 優(yōu)化條件的確定和模型驗證

通過軟件分析確定黑木耳米酒最佳釀造工藝為黑木耳添加量6.18%、甜酒曲接種量0.97%、發(fā)酵溫度29.50 ℃、發(fā)酵時間47.54 h，黑木耳米酒感官評分由公式計算出理論值為91.43分。為方便實際操作，調整黑木耳添加量6.2%、甜酒曲接種量為1.0%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時間47.5 h，得到黑木耳米酒的感官評分為91.6分，實測值與預測值相對誤差為0.19%，測定結果穩(wěn)定，表明該試驗結果具有一定的參考價值。

2.4 理化及微生物指標分析

在黑木耳米酒最佳釀造工藝條件下測定酒精度為9.75%vol；總酸（以乳酸計）為0.78 g/100 g，這兩項理化指標均符合中華人民共和國NY/T1885—2010質量標準。黑木耳米酒中微生物菌落總數29 CFU/g；大腸菌群1.58 MPN/g，未檢出其他致病菌，檢測結果符合中國農業(yè)行業(yè)標準NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》對米酒中微生物的限量要求。針對糯米發(fā)酵制備米酒與黑木耳與糯米混合發(fā)酵制備米酒進行游離氨基酸與還原糖含量對比試驗，結果表明，混合發(fā)酵黑木耳米酒中氨基酸及還原糖含量分別為4.54 g/100 g以及10.73 g/100 g增加率分別為63.95%和60.96%，經分析可知，黑木耳在發(fā)酵過程中利用甜酒曲中的蛋白酶和糖化酶在體外將黑木耳中大分子蛋白及多糖分解成易吸收小分子的氨基酸和寡糖等成分，可促使黑木耳的保健功效在人體內發(fā)揮得更好。

3 結論

根據所建立的響應面模型，以感官評分為評價指標，確定最佳釀造工藝條件為：黑木耳添加量6.2%、甜酒曲接種量為1.0%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間47.5 h，采用此工藝釀造的黑木耳米酒的感官評分為91.6分，其中還原糖及氨基酸理化指標較單獨發(fā)酵米酒增加率超過60%，衛(wèi)生指標符合國家安全標準。黑木耳米酒湯色呈現褐色，有黑木耳清香及米酒香氣，味道協(xié)調柔和，酒體豐滿協(xié)調，有黑木耳米酒獨特的風格，產品兼具營養(yǎng)保健功效，不僅豐富了黑木耳發(fā)酵食品系列，提高黑木耳的利用率，還為開發(fā)新型發(fā)酵酒飲品提供研究方向。