寧煥焱,黃秀麗,賴政煬,羅月珍,趙智鋒
(惠州市食品藥品檢驗所,廣東 惠州 516003)
罌粟殼又名“御米殼”,俗稱“米殼”,為罌粟科植物罌粟(Papaver somniferumL.)的干燥成熟果殼,含有20多種生物堿,以嗎啡、可待因、罌粟堿、那可汀、蒂巴因5種異喹啉型生物堿為主,另含D-甘露庚酮糖、赤蘚醇等[1]。罌粟殼因含生物堿,藥理表現(xiàn)有一定的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、止瀉作用,由于罌粟殼的易成癮性[2],國內(nèi)有不法商販將其加入調(diào)味料中,如火鍋底料、調(diào)料、牛肉湯料等食品中,以達到吸引消費者的目的。消費者長期食用含有罌粟殼的食物,對人體肝臟、腎臟具有毒性損害作用,會使人成癮、記憶性能衰退,嚴重可能對神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)造成損傷,甚至呼吸衰竭[3-4]。鑒于此,我國早在2000年已經(jīng)將罌粟殼歸類為“其他毒品”,2008年,中國衛(wèi)生部發(fā)布《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》[5],罌粟殼就被列為非食用物質(zhì),嚴格監(jiān)管,禁止在食品中添加,禁止非法供應、運輸和使用。
目前,測定罌粟殼生物堿的方法主要有熒光法[6]、層析法[7]、分光光度法[8]、示波極譜法[9]、酶聯(lián)免疫法[10]、氣相色譜法[11]、液相色譜法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-17]。其中,前五種方法只能定性和半定量測定,氣相和液相色譜法因復雜基質(zhì)易產(chǎn)生假陽性,氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法樣品需衍生化處理,超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法因選擇性好、重復性好、靈敏度高應用愈來愈廣泛[16-18]。本研究采用QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)預處理,脫脂去除干擾物。建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定調(diào)味料中5種罌粟殼生物堿的快速分析方法,以期提供一種調(diào)味料中罌粟殼生物堿的高效、靈敏、準確的檢測技術(shù),為食品安全突發(fā)事件及食品中違法添加監(jiān)測及分析檢測提供方法參考。
調(diào)味料(牛肉汁調(diào)味料、調(diào)味料酒、火鍋底料、火鍋蘸料、復合調(diào)味粉、香辛料調(diào)味油):市售;乙腈(色譜純):德國MERCK公司;乙酸乙酯、環(huán)己烷(均為色譜純):美國Thermo Scientific公司;甲酸(優(yōu)級純):上海安譜實驗科技股份有限公司;無水硫酸鎂、氯化鈉(均為分析純):廣州化學試劑廠;固相萃?。╯olid-phase extraction,SPE)凈化萃取管[150 mg無水硫酸鎂,50 mg 乙二胺-N-丙基硅烷,(primary secondary amine,PSA),50 mg C18]:美國Agilent公司;嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁混合標準溶液:美國Stanford Chemicals 公司。
ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S Micro三重四極桿質(zhì)譜儀:美國Waters公司;SorvallTMST 16高速冷凍離心機:美國Thermo Fisher Scientific公司;Synergy超純水機:德國Merck Millipore公司;XS204分析天平:瑞士MettlerToledo公司;MS3渦旋混合器:德國IKA公司;GT-2227QTS超聲波清洗器:廣東固特超聲股份有限公司。
嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁混合標準品溶液(質(zhì)量濃度分別為50 μg/mL、50 μg/mL、10 μg/mL、10 μg/mL、10 μg/mL),置于-18 ℃冷凍保存,用乙腈配制成儲備液,以空白基質(zhì)提取液稀釋成濃度合適的標準工作溶液,置于棕色瓶中,4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 樣品處理方法
稱取均質(zhì)或混勻后樣品2 g(精確至0.01 g)于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中,加5 mL的0.2%甲酸水溶液,渦旋振蕩1 min后,準確加入10 mL的0.2%甲酸乙腈,密塞,渦旋振蕩3 min,超聲提取30 min,加入3 g無水硫酸鎂、3 g氯化鈉,振搖1 min,以12 000 r/min離心5 min。
取上述離心上清液2 mL,置于5 mL或10 mL四氟乙烯具塞離心管中,4 ℃條件下,加2 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(2∶8,V/V)去除脂肪和磷脂,加無水硫酸鎂、PSA、C18(3∶1∶1)混合粉末0.25 g,渦旋混合1 min,以12 000 r/min離心5 min,去除上層,移取乙腈層,經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過濾,待UPLC-MS/MS測定。
空白基質(zhì)制備:根據(jù)配制標準工作曲線的使用量,稱取適量空白基質(zhì)樣品,按上述步驟處理,用于配制標準工作溶液。
1.3.3 液相色譜條件
色譜柱:WatersUPLCHSST3(1.7μm,2.1mm×100 mm);流動相:A相:含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液,B相:0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫:0~0.5 min,90%A;0.5~1.2 min,90%~60%A;1.2~1.8 min,60%A;1.8~2.5 min,60%~90.0%A;2.5~4.0 min,90%A;4.0~4.5 min,90%~60.0%A;4.5~6.0 min,90%。流速:0.4 mL/min;柱溫為40 ℃;進樣量為2 μL。
基于創(chuàng)客教育的第二課堂的主體是大學生。大學生因為興趣而自發(fā)參與,經(jīng)過第二課堂的訓練,成為具有較強實踐能力的創(chuàng)客。
1.3.4 質(zhì)譜條件
電噴霧離子(electrospray ion,ESI)源;正離子模式;毛細管電壓:1.0 kV;離子源溫度:550 ℃;脫溶劑氣流速:1 000 L/h;錐孔氣流速:50 L/h,多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式采集,其他參數(shù)見表1。
表1 5種罌粟殼生物堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters for five alkaloids of poppy husk
1.3.5 方法學考察
對實驗進行方法學驗證,確保方法可行。以DL=3Sb/S=3Sb×C/X計算檢出限,并為系列混合標準溶液確認各自的線性范圍;以完全等同條件多組測定(n=6),分析計算相對標準偏差,驗證精密度,保證結(jié)果的重復性和再現(xiàn)性;以低、中、高3個標品添加水平重復5次計算測定加標回收率,驗證準確度及靈敏度;使其保持良好置信度和檢驗狀態(tài),確保檢測結(jié)果準確、可靠。
罌粟堿中5種生物堿通常以鹽酸溶液、酸化乙醇、酸化乙腈、氨化甲醇為提取溶劑。因為蒂巴因、那可丁幾乎不溶于水,而采用氨化甲醇提取最終會抑制ESI+模式下目標化合物的電離,比較研究上述溶液的提取效果,0.2%甲酸乙腈作為提取溶劑實驗效果理想。
當前,針對罌粟堿生物堿的前處理大部分采用固相萃取小柱凈化,常用的MCX 固相萃取柱除油脂、磷脂效果不佳,HLB固相萃取柱對小分子干擾物去除不佳,該法試驗成本高、操作繁瑣[19-20]。實驗發(fā)現(xiàn),采用QuEChERS前處理樣品,低溫條件下經(jīng)乙酸乙酯-環(huán)己烷(2∶8,V/V)脫脂后,則能達預期較好的凈化效果,該法操作簡便且縮短了檢測周期。
5種生物堿分子結(jié)構(gòu)各不相同,嗎啡和可待因分子結(jié)構(gòu)中因帶有酚羥基,極性較強,蒂巴因、那可丁極性較弱。由于選擇質(zhì)譜ESI+模式分析,為使靶標出峰快、響應好,使用酸性流動相。比較研究了5 mmol/L乙酸銨溶液、0.2%甲酸5 mmol/L甲酸銨溶液、0.1%甲酸10 mmol/L甲酸銨溶液分別配比0.1%甲酸甲醇、乙腈6種流動相搭配,結(jié)果發(fā)現(xiàn)含0.1%甲酸10 mmol/L甲酸銨-乙腈響應理想,色譜分離度、峰型最好。
圖1 5種罌粟殼生物堿混合標準溶液的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of five alkaloids of poppy husk in a standard solution
比較研究反相色譜柱:Waters UPLC HSS T3(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)、Waters BHE C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)、Shim-pack GIS C18(2.0 μm,2.1 mm×100 mm)對罌粟殼中5種生物堿的分離效果,總離子流圖見圖1。由圖1可知,T3柱在相同梯度洗脫條件下,對5種化合物的分離度較高、峰形最佳,5 種物質(zhì)5 min內(nèi)全部出峰。5 種物質(zhì)的保留時間分別為嗎啡(0.90 min)、可待因(2.37 min)、蒂巴因(2.77 min)、罌粟堿(3.05 min)、那可丁(3.38 min),色譜峰分離良好、無拖尾、無叉峰、峰形好。
采用電噴霧正離子模式(ESI+)分析目標化合物,根據(jù)5種生物堿的分子結(jié)構(gòu)特征,通過手動調(diào)諧和自動調(diào)諧相結(jié)合的方式優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù),選取靈敏度好、豐度高、干擾小的碎片離子作為定性、定量離子,建立多離子反應監(jiān)測(MRM)方法。
2.4.1 線性范圍和檢出限
采用空白基質(zhì)制備系列混合標準工作溶液,以質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標,峰面積(y)為縱坐標繪制5種罌粟殼生物堿的標準曲線,得到5 種生物堿的標準曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)R,以信噪比(signal-to-noise ratio,SNR)=3確定待測物的檢出限(limit of detection,LOD),SNR=10確定待測物的定量限(limits of quantitation,LOQ),檢出限和定量限見表2。由表2可知,其中嗎啡、可待因在0.50~200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,蒂巴因在0.05~50 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,鹽酸罌粟堿和那可丁在0.10~100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R均>0.999。嗎啡、可待因的檢出限和定量限分別為3.0 μg/kg、10.0 μg/kg;蒂巴因、鹽酸罌粟堿和那可丁的檢出限和定量限分別為0.6 μg/kg、2.0 μg/kg。
表2 5種罌粟殼生物堿的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)R、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients,limits of detection and limits of quantitation of five alkaloids in poppy husk
2.4.2 回收率、精密度試驗
調(diào)味品陰性樣品中分別添加低、中、高3個不同濃度水平的混合標準溶液,每個添加水平重復6次,嗎啡、可待因的添加水平為2.5 μg/kg、25.0 μg/kg、50.0 μg/kg,罌粟堿、那可丁、蒂巴因為0.5 μg/kg、5.0 μg/kg、10.0 μg/kg。以基質(zhì)空白工作曲線回歸方程進行定量,計算方法的回收率及相對標準偏差(relative standard deviation,RSD),結(jié)果見表3。
表3 5種罌粟殼生物堿的精密度及加標回收率試驗結(jié)果Table 3 Results of precision and standard recoveries rate tests of 5 kinds of poppy husk
5種罌粟殼生物堿的平均回收率為65.7%~108.2%,回收率試驗結(jié)果相對標準偏差(RSD)為1.24%~8.71%,精密度試驗結(jié)果相對標準偏差為0.43%~1.85%。結(jié)果表明,該方法的精密度、準確度良好,可以滿足調(diào)味品中5 種罌粟殼生物堿的痕量分析測定要求。
以超市和農(nóng)批市場所購買的6種不同品種調(diào)味料進行檢測,同時做1個質(zhì)控樣品,應用該方法分別檢測5種罌粟殼生物堿,結(jié)果見表4。由表4可知,火鍋底料有檢出,呈陽性,復檢做平行樣取平均值,該火鍋底料做質(zhì)控樣并以表3對應添加水平計算其含量,其余5種樣品呈陰性,表明調(diào)味品中仍存在非法添加現(xiàn)象,未來將進一步擴大檢測范圍,為監(jiān)管提供技術(shù)保障。
表4 不同品種調(diào)味料中5種罌粟殼生物堿含量的檢測結(jié)果Table 4 Determination results of five alkaloids of poppy husk contents in different kinds of seasonings μg/kg
本實驗建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測調(diào)味品中5種罌粟堿的分析方法,在提取和凈化過程中采用QuEChERS 前處理方法,乙酸乙酯-環(huán)己烷(2∶8)脫脂,有效去除了雜質(zhì)對目標檢測物的干擾,降低基質(zhì)效應,同時優(yōu)化了儀器檢測參數(shù),提高了檢測的靈敏度。該方法快速、簡便、靈敏、準確,精密度試驗結(jié)果相對標準偏差為0.43%~1.85%,回收率在65.7%~108.2%之間,相對標準偏差為1.24%~8.71%,表明該方法精密度及準確度良好,檢測速度快,適用于調(diào)味品中非法添加罌粟殼的定性定量檢測,能為大批量檢測保駕護航,同時,為食品安全監(jiān)管工作提供技術(shù)支持和參考。