孫子羽，滿都拉，陳 佳，劉 婷，溫 慧，陳忠軍*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

乳清是生產(chǎn)干酪和干酪素的副產(chǎn)物，含有乳中近一半的營(yíng)養(yǎng)成分，其中干物質(zhì)約含6%～8%，粗蛋白質(zhì)1%，粗脂肪0.3%～0.4%，總糖3%～5%（乳糖占99.8%）[1]。目前乳清處理方式不能有效促進(jìn)乳清再利用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3]。因此，利用乳清或其干燥產(chǎn)物生產(chǎn)乳清干酪[4]、濃縮乳清蛋白[5]、乳清蛋白酶解產(chǎn)物[6-8]、乳糖和乳清飲料等高附加值的產(chǎn)品是未來(lái)的主要發(fā)展方向[9]。

黑枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）為茄科枸杞屬多棘刺灌木，在我國(guó)主要分布于青海、寧夏、新疆、甘肅、西藏等省區(qū)[10]，以其花青素含量豐富而著名[11]。黑枸杞除花青素外還含有脂肪、蛋白質(zhì)、糖類、氨基酸、有機(jī)酸、微量元素以及維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分[12]，具有抗氧化、抗疲勞、降壓、抗心血管疾病等功能，具備廣闊的應(yīng)用前景，是近年來(lái)食品研究與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)[13-16]。

目前對(duì)黑枸杞的研究主要集中于黑枸杞營(yíng)養(yǎng)成分等，也有對(duì)黑枸杞與葡萄、靈芝、紅棗、苦蕎和仙人掌等結(jié)合生產(chǎn)復(fù)合飲料的研究[17-21]。而以黑枸杞為原料的乳清酒未有報(bào)道，本研究以乳清粉和黑枸杞為原料制備乳清酒，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)乳清酒發(fā)酵原料的配比及工藝進(jìn)行優(yōu)化，并利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（head space solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法鑒定黑枸杞乳清酒揮發(fā)性風(fēng)味成分，以期為黑枸杞乳清酒中香味物質(zhì)的認(rèn)識(shí)和乳清高附加值產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑枸杞：銀川杞里鄉(xiāng)商貿(mào)有限公司；乳清粉：新西蘭恒天然集團(tuán)有限公司；啤酒酵母：安琪酵母股份有限公司；乳糖酶（10萬(wàn)U/g）：山東圣斯德食品添加劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10精密電子pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SPME裝置：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Trace1300-ISQ型GC-MS聯(lián)用儀、U3000高效液相色譜儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 黑枸杞乳清酒生產(chǎn)工藝流程及操作要點(diǎn)

原料選擇：選擇無(wú)霉變、無(wú)病蟲(chóng)害的黑枸杞干。

黑枸杞汁制備：將黑枸杞進(jìn)行研磨，按照1∶5（g∶mL）加入水，攪拌均勻，靜置30 min，取上清。

乳清液制備：乳清粉按照1∶10（g∶mL）加水溶解，制得10%的乳清溶液，加入0.7%的乳糖酶，攪拌均勻后35 ℃酶解3 h。

殺菌：65 ℃水浴30 min。

成分調(diào)整：按200 g/L加入蔗糖。

菌株活化：啤酒活性干酵母按料水比為1∶10（g∶mL）配制，加入2%蔗糖，置于35 ℃水浴鍋中活化30 min至大量起泡即酵母活化完成。

接種：在超凈工作臺(tái)中完成，以防止污染。

發(fā)酵：發(fā)酵瓶用帶有單向閥的瓶蓋密封，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。

過(guò)濾：用砂芯漏斗過(guò)濾不溶性固形物。

1.3.2 黑枸杞乳清酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

固定初始原料體積比（黑枸杞汁∶乳清汁）1∶4，接種量1%，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間120 h。分別改變?cè)象w積比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6）、接種量（0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%）、發(fā)酵時(shí)間（96 h、108 h、120 h、132 h、144 h），對(duì)黑枸杞乳清酒粗品進(jìn)行感官評(píng)定以確定原料體積比、接種量和發(fā)酵時(shí)間的最佳水平。

1.3.3 黑枸杞乳清酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，考察原料體積比（A）、接種量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）對(duì)黑枸杞乳清酒感官品質(zhì)的影響，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 黑枸杞乳清酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of black medlar whey wine

1.3.4 測(cè)定方法

感官評(píng)價(jià)：根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16861—1997《感官分析通過(guò)多元分析方法鑒定和選擇用于建立感官剖面的描述詞》，選擇描述詞，根據(jù)GB/T 10220—2012《感官分析方法學(xué)總論》建立感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，滿分100分，見(jiàn)表2。選定20人（男、女各10人），根據(jù)表2標(biāo)準(zhǔn)主要圍繞色澤、香氣、口感和組織狀態(tài)對(duì)黑枸杞乳清酒進(jìn)行感官評(píng)定。

表2 黑枸杞乳清酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of black medlar whey wine

黑枸杞乳清酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析：利用HS-SPMEGC-MS法[22]，量取8.0 mL黑枸杞乳清酒放入20 mL SPME樣品瓶中，將老化后的萃取頭插入樣品瓶頂空部分進(jìn)行萃取，在60 ℃水浴條件下平衡10 min，萃取頭頂空吸附30 min后，在GC進(jìn)樣口釋放1 min。

氣相色譜-質(zhì)譜條件：DB-5毛細(xì)色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣（He）；載氣流速1.0 mL/min；離子源溫度230 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度50 ℃保持1 min，以2 ℃/min升溫至100 ℃保持3 min，再以4 ℃/min升溫至220 ℃保持10 min，不分流進(jìn)樣；質(zhì)量掃描范圍50～550 m/z；溶劑延遲時(shí)間1 min。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

單因素和正交試驗(yàn)中每個(gè)水平做3次平行試驗(yàn)。利用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（采用一般線性模型單因素Duncan法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑枸杞乳清酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 黑枸杞汁與乳清汁體積比的確定

由圖1可知，黑枸杞乳清酒感官評(píng)分隨黑枸杞汁與乳清汁體積比的減少呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)。在黑枸杞汁與乳清汁的體積比為1∶3時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值89.1分，此時(shí)酒體色澤鮮明，口感純正，故黑枸杞汁與乳清汁最佳體積比確定為1∶3。

圖1 黑枸杞汁與乳清汁比例對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of the ratio of black medlar to whey on sensory evaluation

2.1.2 接種量的確定

圖2 接種量對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of inoculum on sensory evaluation

由圖2可知，在原料比例固定情況下，黑枸杞乳清酒感官評(píng)分隨接種量的增加整體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。在接種量為1.0%時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最大值84.1分，此時(shí)黑枸杞乳清酒香味協(xié)調(diào)，口感平衡，故最佳接種量確定為1.0%。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間的確定

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of fermentation time on sensory evaluation

由圖3可知，在其他條件不變情況下，發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑枸杞乳清酒感官評(píng)分的影響類似于接種量對(duì)其的影響。在發(fā)酵120 h時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最大值89.9分，此時(shí)黑枸杞乳清酒光澤協(xié)調(diào)，酒體醇厚。隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵液糖度下降和酒精度升高使黑枸杞乳清酒口感缺少柔和性，故最佳發(fā)酵時(shí)間確定為120 h。

2.2 黑枸杞乳清酒發(fā)酵條件優(yōu)正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以黑枸杞汁與乳清液的比例、酵母接種量和發(fā)酵時(shí)間為評(píng)價(jià)因素，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果與分析見(jiàn)表3。

表3 黑枸杞乳清酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of black medlar whey wine

由表3可知，影響黑枸杞乳清酒感官評(píng)價(jià)的因素主次順序?yàn)楹阼坭街c乳清液體積比（A）＞發(fā)酵時(shí)間（C）＞接種量（B），最優(yōu)工藝組合為A2B3C1，即黑枸杞汁∶乳清液為1∶3、接種量1.1%、發(fā)酵時(shí)間115 h，在此條件下所得黑枸杞乳清酒的感官評(píng)分為90.2分。

2.3 黑枸杞乳清酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

采用HS-SPME結(jié)合GC-MS萃取分離鑒定黑枸杞乳清酒中的揮發(fā)性成分，通過(guò)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，黑枸杞乳清酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成見(jiàn)表4。

由表4可知，在檢測(cè)到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中，酯類化合物所占的比例最大，占全部揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的72.42%，共有41種，其中癸酸乙酯含量最高，占總揮發(fā)性物質(zhì)的28.57%，其次是辛酸乙酯，占20.87%。癸酸乙酯具有有椰子香味[23]，辛酸乙酯具有梨子香味[24]。酯類物質(zhì)是酒體中最活躍的成分，整體提供了怡人的果香香氣，可使黑枸杞乳清酒變得清甜醇香[25]。

表4 黑枸杞乳清酒揮發(fā)性成分的GC-MS聯(lián)用分析結(jié)果Table 4 Analysis of volatile substances in black medlar whey wine by GC-MS

續(xù)表

醇類物質(zhì)所占比例僅次于酯類物質(zhì)，占檢出總量的24.76%。共有10種，其中異戊醇和2-甲基丁醇含量較高，分別為9.29%和6.72%。異戊醇有蘋果白蘭地香氣和辛辣味[26-27]，2-甲基丁醇是一種香味成分，這兩種物質(zhì)在形成黑枸杞乳清酒整體風(fēng)味中具有重要作用。

酸類物質(zhì)檢測(cè)到4種，分別為己酸、辛酸、順式-13-十八酸和E-9-十四烯酸，只占風(fēng)味物質(zhì)檢出總量的0.39%。適量的酸可對(duì)黑枸杞乳清酒起緩沖作用，協(xié)調(diào)、烘托黑枸杞乳清酒的主體香。酚類物質(zhì)檢測(cè)到2種，其中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚具有香辛料、丁香和發(fā)酵樣香氣，兼具有炒花生香氣。另外，還檢測(cè)到1種醛類物質(zhì)、1種酮類物質(zhì)和9種烴類及其衍生物，這些物質(zhì)共同構(gòu)成了黑枸杞乳清酒獨(dú)特的風(fēng)味。

3 結(jié)論

采用單因素及正交試驗(yàn)對(duì)以乳清粉和黑枸杞為原料的黑枸杞乳清酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，黑枸杞乳清酒最佳發(fā)酵工藝為黑枸杞汁與乳清液體積比1∶3、接種量1.1%、發(fā)酵時(shí)間115 h、發(fā)酵溫度28 ℃。在此工藝條件下，得到的黑枸杞乳清酒呈透亮紫色、口感純正、風(fēng)味良好，感官評(píng)分為90.2分。

利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析黑枸杞乳清酒揮發(fā)性風(fēng)味成分，共鑒定出68種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中包括酯類41種（含量72.42%），醇類10種（含量24.76%），酸類4種（含量0.39%），醛類1種（含量0.14%），酚類2種（含量0.53%），酮類1種（含量0.04%），烴類及其衍生物9種（含量1.70%）。黑枸杞乳清酒中主要風(fēng)味物質(zhì)為酯類、醇類和酸類。主要風(fēng)味化合物為癸酸乙酯（28.57%）和辛酸乙酯（20.87%）等。