王 言，顧以韌，楊雪梅，梁 艷，楊躍奎，陶 璇，鐘志君，陳曉輝，曾 凱，何志平，呂學斌（四川省畜牧科學研究院動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066）

微RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼的內源性小分子RNA，在生物中普遍存在。大小只有19～24 個核苷酸，它們廣泛存在于多種真核生物體中，通過與靶mRNA 的3'UTR（非編碼區(qū)域）互補結合，可降解該mRNA 或抑制其翻譯，其在基因表達調控、生物個體發(fā)育、代謝、疾病發(fā)生和免疫調控等生理過程中均發(fā)揮著重要的作用[1-3]。miR-23a 以ZNF423 為靶基因，抑制牛胎兒骨骼肌來源的前體脂肪細胞分化過程[4]。miR-151-3p 通過ATP2a2 參與調控慢肌的發(fā)生發(fā)育過程[5]。Ana等研究發(fā)現(xiàn)miR-199a 能促進成年小鼠心肌細胞重新進入細胞周期，并且促進新生小鼠和成年小鼠心肌細胞的增殖[6]。miR-299 是調控生肌調節(jié)因子Myf6 的候選miRNA，可正向調控C2C12 成肌細胞分化[7]。miR-497 參與心肌細胞的早期發(fā)育[8]，miR-497 表達量的提高是成肌分化的前提條件，并且miR-497 可能通過HMGA1-Id 通路調控成肌分化[9]。

豬是畜牧生產(chǎn)中重要的家畜，它作為人類最重要的蛋白質來源之一，具有重要的經(jīng)濟價值。隨著生活水平的提高，消費者對肉質好、營養(yǎng)健康的優(yōu)質豬肉產(chǎn)品的需求量劇增。然而過去的幾十年間，對豬的遺傳改良主要集中在一味提高生長速度和增加瘦肉率等生長和胴體性狀方面，這也導致了豬肉品質的急劇下降[10-11]，故在生產(chǎn)生長速度快、瘦肉率高的豬同時，兼顧到豬肉品質好已成為目前豬育種界的研究熱點。藏豬、雅南豬、內江豬和大約克夏豬在胴體和豬肉品質上呈現(xiàn)巨大表型差異，使其成為肉質相關研究的理想試驗材料。鑒于上述miRNA 與調控肌肉與脂肪細胞分化過程有密切的關系，本研究以經(jīng)過高度人工選育的引進豬種大約克夏豬、選育程度較低的地方豬種（雅南豬、內江豬）以及四川省特有的高原型品種藏豬為研究對象，采用Q-PCR 技術對其背最長肌組織中miR-23a、miR-151、miR-299、miR-199a 和miR-497 的表達與肉質性狀的差異進行了研究。該研究為闡明不同豬種肉質差異形成的分子機制提供基礎數(shù)據(jù)，將為優(yōu)質風味豬育種提供重要的科學依據(jù)。

1 試驗時間、地點與試驗材料

試驗在四川省畜牧科學研究院養(yǎng)豬所科研基地進行。選擇健康狀況良好、日齡相近的藏豬、雅南豬、內江豬和大約克夏豬各3 頭，于2015 年12 月開始組建群體，分圈飼養(yǎng)，并在相同條件下飼喂，試驗期間所有豬自由采食飲水。所有試驗豬達9 月齡時進行屠宰，宰前空腹24 h，自由飲水。屠宰后迅速采集左胴體倒數(shù)第3、4 肋骨間背最長肌組織樣本，用于后續(xù)的肉質表型指標測定和RNA 提取。

2 試驗方法

2.1 肉質性狀表型指標的測定

2.1.1 肌內脂肪含量的測定 利用全自動索氏抽提儀（BUCHI 公司）測定豬背最長肌中肌內脂肪的含量。樣品處理和試驗方法按照《肉與肉制品游離脂肪含量測定》（GB/T 9695.1—2008）進行操作。

2.1.2 肌纖維面積的測定 利用冰凍切片法和HE染色法制作背最長肌組織樣品的冰凍切片，通過顯微圖像分析軟件計算樣品的肌纖維直徑（面積）。

2.1.3 硫胺素含量的測定 樣本處理和試驗方法參照國家標準《食品中硫胺素（維生素B1）的測定》（GB/T 5009.84—2003）。

2.1.4 眼肌面積和瘦肉率的測定 測量左胴體倒數(shù)第3、4 肋間眼肌的寬、高，按照寬×高×0.7 計算眼肌面積。按照《豬胴體性狀測定技術規(guī)范》（NY/T 825—2004）方法操作并計算瘦肉率。

2.2 qRT-PCR 檢測

2.2.1 肌肉組織中總RNA 的提取 組織RNA 抽提使用Qiagen 公司的miRNeasy Mini Kit 試劑盒，RNA抽提過程嚴格按照試劑盒說明書進行。為保證RNA的質量，抽提得到的RNA 采用瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳和生物分析儀Agilent 2100 進行質量檢測合格后，方可分別用于后續(xù)的熒光定量試驗。

2.2.2 qRT-PCR 的操作步驟 采用反轉錄試劑盒根據(jù)操作說明書將RNA 轉錄成cDNA，在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad 公司生產(chǎn)）上進行熒光定量檢測。反應體系（20 μL）：Sso－Fast EvaGreen 混合液10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物1 μL，RNA－free water（Ambion, USA）7 μL。5S、18S 和U6 作為miRNA 定量的內參基因，引物信息見表1。所有目的miRNA 定量結果均通過熔解曲線分析驗證PCR 產(chǎn)物的特異性，確保產(chǎn)物無引物二聚體，每個樣本重復3 次，每次檢測含3 個陰性對照。采用2－ΔΔCt法計算目的miRNA 的相對表達量。

表1 引物信息

2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用SPSS 軟件對miRNA 相對表達量和肉質表型指標進行Duncan 分析其差異顯著性，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示；采用Sigmaplot 12.0 中的Pearson Correlation 程序分析miRNA 相對表達量和表型指標的相關性。

3 結果與分析

3.1 相關肉質指標含量

由表2 可知，在4 個豬種中，藏豬和內江豬的肌內脂肪含量最高（4.91%），其次為雅南豬（3.87%），約克夏豬最低（2.04%），3 個地方豬種的肌內脂肪含量顯著高于外種豬（P＜0.05）；藏豬肌纖維面積最?。? 712.86 μm2），顯著或極顯著小于其他3個豬種（P＜0.05），約克夏豬肌纖維面積最大（6 703.31 μm2），極顯著大于藏豬和內江豬（P＜0.01），顯著大于雅南豬（P＜0.05）；3 個地方豬種的眼肌面積在14～22 cm2之間，藏豬、雅南豬和內江豬的眼肌面積均極顯著小于約克夏豬；3 個地方豬之間瘦肉率差異不顯著，約克夏豬瘦肉率最高（63.84%），極顯著高于3 個地方豬（P＜0.01）；雅南豬的硫胺素含量最高（2.79 μg/g），顯著高于其他3 個豬種（P＜0.05），其次是藏豬（1.94 μg/g），內江豬和約克夏豬最低（1.11 μg/g），顯著低于雅南豬和藏豬（P＜0.05）。

3.2 5 種miRNA 在不同豬種中的表達水平

采用Q-PCR 的方法檢測了5 種miRNA 在豬背最長肌中的相對表達量，結果見表3。由表3 可知，miR-23a 在藏豬中的相對表達量高于其他3 個豬種，但差異不顯著（P＞0.05）；miR-151 在藏豬中相對表達量最高，顯著高于雅南豬和大約克夏豬（P＜0.05），雅南豬的miR-151 相對表達量顯著高于約克夏豬（P＜0.05）；miR-199a 在約克夏豬中相對表達量最高，顯著高于其他3 個豬種（P＜0.05）；miR-299 在約克夏豬中相對表達量最高，在藏豬中相對表達量最低，約克夏豬的miR-299 相對表達量顯著高于藏豬和內江豬（P＜0.05），雅南豬的miR-299 相對表達量顯著高于藏豬（P＜0.05）；miR-497 在約克夏豬中相對表達量最高，在內江豬中最低，約克夏豬中的miR-497 表達水平顯著高于藏豬和內江豬（P＜0.05），藏豬和雅南豬中的miR-497 表達水平顯著高于內江豬（P＜0.05）。

表3 5 種miRNA 在不同豬種中的表達水平

3.3 5 種miRNA 的相對表達水平與肉質相關指標含量的相關性

采用Sigmaplot 12.0 分析了肉質形狀相關指標和基因表達量的相關性。由表4 可知，miR-23a 和miR-151 在豬背最長肌中表達水平與肌內脂肪含量和硫胺素呈正相關，與肌纖維面積、眼肌面積、瘦肉率呈負相關，其中miR-151 在背最長肌中的表達水平與肌內脂肪含量、肌纖維面積、眼肌面積和瘦肉率呈極顯著相關性（P＜0.01）；miR-199a、miR-299 和miR-497 在豬背最長肌中的表達水平與肌內脂肪和硫胺素呈負相關，與肌纖維面積、眼肌面積、瘦肉率呈正相關，其中miR-199a 的表達水平與瘦肉率呈顯著正相關（P＜0.05），miR-299 的表達水平與肌內脂肪含量呈顯著負相關（P＜0.05），與肌纖維面積呈顯著正相關（P＜0.05），miR-497 的表達水平與肌內脂肪含量呈顯著負相關（P＜0.05），與瘦肉率呈顯著正相關（P＜0.05）。

表4 5 種miRNA 的相對表達水平與肉質相關指標含量的相關性

4 討論

豬肉風味品質的形成是涉及多基因、多途徑和多階段的復雜生理生化過程[12]。肌內脂肪含量越高，則肉的多汁性越好，所以肌內脂肪含量是豬肉口感的決定性因素之一；本研究中的3 個地方豬種的肌內脂肪含量（IMF）顯著高于大約克夏豬，肉質口感更好。肌纖維直徑越細，肉質就越細嫩；本研究中3個地方豬種的肌纖維面積都小于約克夏豬，所以肉質也較為細嫩。硫胺素是一種非常重要的風味前體物質，其熱降解是食品加工過程中風味形成的主要途徑之一；本研究中藏豬和雅南豬肌肉中的硫胺素含量顯著高于內江豬和約克夏豬，肉質風味更好。胴體瘦肉率是評價胴體品質的主要指標，與眼肌面積呈極顯著正相關，與肌內脂肪含量呈負相關，胴體瘦肉率過高會降低豬肉品質。本研究中藏豬、雅南豬、內江豬是四川省主要地方豬種資源，以耐粗飼，肉質優(yōu)良，肌肉顏色鮮紅、系水力強、細嫩多汁、富含肌內脂肪而著稱，但其生長速度慢，瘦肉率在43%～48%之間，飼料轉化率低，屬選育程度較低的豬種；而從國外引進的大約克夏豬以高生長速度、高瘦肉率（63.84%）而著稱，但其肉質相對較差，屬典型經(jīng)過高度選育的瘦肉型豬種。綜上所述，3 個地方豬種相對于大約克夏豬，均屬于肉質優(yōu)良豬種，其肉質口感多汁細膩、風味較好，但瘦肉率較低，可作為優(yōu)質風味豬的育種素材。

miRNA 對豬肌肉發(fā)育有著重要的調節(jié)作用。豬miR-23a 可靶向作用于Smad3 基因[13]，Smad3 可通過干擾MyoD 的活性和表達來調節(jié)Myostatin 的信號通路，從而抑制骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化[14]。miR-151在成肌細胞發(fā)育過程中的增殖階段表達量增加，而在分化階段表達量降低[5]。研究表明miR-199a 在肌肉發(fā)育過程中起重要作用[15]，在miR-199a/miR-214基因簇被敲除后背最長肌發(fā)育受到影響[16]。Yap 是miR-299 的潛在靶基因，Yap 是hippo 通路的成員，在C2C12 細胞的分化、肌衛(wèi)星細胞命運的決定、肌肉纖維類型、肌肉萎縮等過程中有重要的作用[17-19]。miR-195/497 表達量的改變在小鼠模型和成肌細胞中影響Myogenin 的表達量，而鐘嘉勝[9]研究指出Myogenin 具有增加胴體瘦肉率和眼肌面積，減低皮脂含量，提高腿臀比例，增加胴體長度等提高胴體肉品質的效應，另外Myogenin 同樣影響著肉質的劣變。本研究中miRNA 相對表達量的結果顯示，miR-23a、miR-151 在3 個脂肪型豬種中的表達量均高于瘦肉型豬種大約克夏豬，而miR-199a、miR-299 和miR-497 在大約克夏豬中的相對表達量高于在3 個脂肪型豬種中的相對表達量；相關性分析結果顯示，miR-23a、miR-151 與肌內脂肪含量和硫胺素含量呈正相關，與肌纖維面積、眼肌面積和瘦肉率呈負相關，而miR-199a、miR-299 和miR-497 與肌內脂肪含量和硫胺素含量均呈負相關，與肌纖維面積、眼肌面積和瘦肉率呈正相關。這表明miR-23a、miR-151對豬肉品質具有正向調控作用，對豬胴體性能具負向調控作用；miR-199a、miR-299 和miR-497 對豬肉品質具有負向調控作用，對豬胴體性能具正向調控作用。

這5 種miRNA 與豬肌肉生長和脂肪沉積密切相關，本研究結果可為闡明豬肉品質形成的分子機理提供基礎數(shù)據(jù)，也為通過調控其表達水平從而改善豬肉質和提高豬胴體性能提供了可能。