李 嬌，王文秀，李 峰，沈志強(qiáng)，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS），又稱豬地方流行性肺炎（porcine enzootic pneumonia, PEP），俗稱豬喘氣病，是由豬肺炎支原體（Mycoplasmal hyopneumonia, Mhp）引起的以咳嗽、氣喘、生長(zhǎng)發(fā)育不良、高發(fā)病率和低死亡率為主要特征的一種慢性、接觸性呼吸道傳染病，該病長(zhǎng)期存在并嚴(yán)重威脅著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展[1-2]。豬肺炎支原體常常與多殺性巴氏桿菌、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）等致病原繼發(fā)感染或混合感染[3]。當(dāng)其單獨(dú)感染時(shí)，僅出現(xiàn)亞臨床癥狀，表現(xiàn)溫和，可引起平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率降低。當(dāng)其與其他致病原繼發(fā)感染時(shí)，出現(xiàn)呼吸困難、發(fā)熱等典型臨床癥狀，增加了呼吸道疾病的嚴(yán)重性和持久性，導(dǎo)致死亡率上升，防控難度增加。該病具有感染率高、傳染性強(qiáng)的特點(diǎn)，一旦傳入豬群，很難徹底清除，是目前影響我國(guó)養(yǎng)豬經(jīng)濟(jì)效益的頑固性疫病之一，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。加強(qiáng)流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和診斷技術(shù)研究對(duì)該病綜合防控措施的制定具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。為全面掌握目前我國(guó)豬群中豬肺炎支原體的流行現(xiàn)狀，筆者通過(guò)查閱2000 年以來(lái)我國(guó)研究學(xué)者在病原分離鑒定、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、遺產(chǎn)變異分析等方面的研究資料，整理與分析出了目前我國(guó)豬支原體肺炎的感染現(xiàn)狀與流行特點(diǎn)，并綜述了豬肺炎支原體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展，對(duì)我國(guó)豬支原體肺炎的綜合防控具有重要的參考價(jià)值。

1 病原分離鑒定情況

對(duì)近十余年國(guó)內(nèi)豬肺炎支原體的分離鑒定情況進(jìn)行匯總分析，結(jié)果如表1 所示，可見我國(guó)豬肺炎支原體的分離鑒定成功率較低，2006—2016 年國(guó)內(nèi)研究學(xué)者共從164 份臨床病料樣品中成功分離鑒定出豬肺炎支原體9 株，病原分離鑒定成功率僅為5.49%（9/164），分析其原因可能為豬肺炎支原體對(duì)營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件要求極其苛刻，導(dǎo)致其成功分離鑒定率極低，成為當(dāng)前最難分離的支原體種類之一。同時(shí)，由表1 可見豬肺炎支原體在我國(guó)的感染范圍較廣，9 株豬肺炎支原體分離株覆蓋了由南到北的云南省、廣東省、湖南省、四川省、江蘇省、河南省、山西省、山東省、吉林省等9 個(gè)省份，呈全國(guó)性流行。

表1 豬肺炎支原體分離鑒定情況匯總

2 流行病學(xué)監(jiān)測(cè)情況

隨著我國(guó)對(duì)豬肺炎支原體感染的逐步重視，研究學(xué)者先后對(duì)不同地區(qū)的豬肺炎支原體感染情況進(jìn)行了流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，結(jié)果如表2 所示，我國(guó)不同地區(qū)均存在不同程度的豬肺炎支原體感染，感染情況比較普遍，且在部分地區(qū)感染率較高，感染情況比較嚴(yán)峻，如2014 年廣東東莞地區(qū)的感染率高達(dá)86.92%，2016 年西藏林芝地區(qū)的感染率達(dá)72.69%。豬肺炎支原體已在我國(guó)豬群中廣泛流行，需采取積極的綜合防控措施進(jìn)行有效防制。

表2 豬肺炎支原體流行病學(xué)監(jiān)測(cè)情況匯總

3 遺傳變異分析情況

對(duì)豬肺炎支原體進(jìn)行遺傳變異分析可以從分子水平發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間、不同地區(qū)流行株之間的差異以及遺傳和衍化規(guī)律，能夠?yàn)椴煌貐^(qū)因地制宜的制定防控措施提供參考。廖永洪等[5]對(duì)河南省HN0613分離菌株進(jìn)行了P36 基因的PCR 擴(kuò)增、克隆及測(cè)序，并對(duì)其序列變異、遺傳進(jìn)化進(jìn)行分析，結(jié)果表明HN0613 分離菌株P(guān)36 基因序列與GenBank 中登錄的豬肺炎支原體P36 基因序列同源性均在98%以上，HN0613 分離菌株P(guān)36 基因未發(fā)生較大變異?？琢钤龅萚9]對(duì)豬肺炎支原體廣東分離株的P46 基因、P65 蛋白C 末端的基因編碼序列和P97 蛋白R(shí)1R2區(qū)域的基因編碼序列進(jìn)行遺傳變異分析，結(jié)果表明P46 基因、P65 基因、P97 基因與標(biāo)準(zhǔn)株J 株、232 株和7448 株的核苷酸序列同源性分別為98.9%～99.1%、99.2%～99.7%、86.6%～96.0%，豬肺炎支原體廣東分離株P(guān)46 基因、P65 基因片段高度保守，而P97 基因片段的變異較大。李石等[16]對(duì)新疆北疆部分地區(qū)122 份豬支原體肺炎陽(yáng)性樣品進(jìn)行P36 基因序列分析，與參考菌株同源性為97.3%～100%，僅有個(gè)別堿基發(fā)生突變，未發(fā)生較大變異。以上分子流行病學(xué)調(diào)查資料表明，我國(guó)豬肺炎支原體的流行菌株未發(fā)生較大變異，常規(guī)疫苗能夠提供良好的免疫保護(hù)。

4 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

豬肺炎支原體常常與多殺性巴氏桿菌、PRRSV、PCV2、PRV、CSFV 等致病原混合感染?；旌细腥炯又亓思膊〉膰?yán)重程度，同時(shí)也增加了豬肺炎支原體的臨床診斷難度，故目前對(duì)豬肺炎支原體感染的確診主要依靠實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)。

4.1 PCR 方法

PCR 方法以樣品基因組DNA 為模板，借助DNA 聚合酶體外大量擴(kuò)增目的片段，具有簡(jiǎn)便、迅速、特異、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，但該方法的敏感性有限，容易漏檢。李瑩瑩等[20]根據(jù)GenBank 中豬肺炎支原體P46基因序列設(shè)計(jì)合成1 對(duì)特異性檢測(cè)引物，經(jīng)PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)豬肺炎支原體的PCR 方法，該方法檢測(cè)豬鼻支原體、豬絮狀支原體、雞毒支原體、豬胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌均為陰性，最低可檢出0.675 ng 的基因組DNA，可滿足臨床上對(duì)豬肺炎支原體的快速檢測(cè)要求。

4.2 熒光定量PCR 方法

熒光定量PCR 技術(shù)結(jié)合了常規(guī)PCR 方法靈敏、快速、特異的特點(diǎn)以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，但該方法對(duì)儀器設(shè)備和技術(shù)人員操作水平要求均較高。宋建領(lǐng)等[21]根據(jù)GenBank登錄的豬肺炎支原體黏附素P97 基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物和1 條探針，建立了豬肺炎支原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法，該方法能特異地檢測(cè)出豬肺炎支原體，檢測(cè)PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、乙型腦炎病毒（JEV）、豬細(xì)小病毒（PPV）等病原均為陰性，檢測(cè)豬肺炎支原體陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度可以達(dá)到10 拷貝，重復(fù)性檢測(cè)Ct 值變異系數(shù)在0.78%～1.16%之間。實(shí)時(shí)定量PCR 方法具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性，可用于豬肺炎支原體感染的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查，是一種值得推廣的快速診斷技術(shù)。

4.3 巢式PCR 方法

巢式PCR 是在常規(guī)PCR 結(jié)束后，以第一輪PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR 擴(kuò)增，故其敏感性更高，適合對(duì)病毒含量很低時(shí)的樣品進(jìn)行鑒定。吉瑪?shù)萚22]根據(jù)GenBank 上登錄的豬肺炎支原體基因組序列，在保守區(qū)基因內(nèi)部設(shè)計(jì)合成2 對(duì)引物，經(jīng)過(guò)PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)豬肺炎支原體的巢式PCR 方法，該方法檢測(cè)雞毒支原體、豬鼻支原體、豬胸膜肺炎放線桿菌、PCV2、PRV 均為陰性，第1 次擴(kuò)增的敏感性是10 pg，第2 次擴(kuò)增的敏感性是0.1 pg，第2 次比第1 次擴(kuò)增的敏感性高100 倍。應(yīng)用該方法檢測(cè)26 份臨床疑似豬肺炎支原體感染的病料，檢出陽(yáng)性樣品15 份，隨機(jī)選取10 份陽(yáng)性樣品PCR 產(chǎn)物進(jìn)行克隆與序列測(cè)定，結(jié)果顯示10 份陽(yáng)性產(chǎn)物均為豬肺炎支原體。巢式PCR 方法的敏感性可與熒光定量PCR 方法相當(dāng)，但所用儀器與試劑只是普通的PCR 儀器與試劑，不需要熒光定量PCR方法要求的特殊儀器設(shè)備與試劑，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可以在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確快速地檢測(cè)出極低含量的豬肺炎支原體，具有良好的臨床實(shí)用價(jià)值。

4.4 LAMP 方法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（LAMP）是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，其特異性和敏感性可以與熒光PCR 媲美，同時(shí)其檢測(cè)周期短、操作簡(jiǎn)便、對(duì)檢測(cè)硬件設(shè)備的要求較低，適合于野外現(xiàn)場(chǎng)使用。熊煒等[23]根據(jù)豬肺炎支原體基因序列設(shè)計(jì)6 對(duì)檢測(cè)引物，經(jīng)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)豬肺炎支原體的LAMP 方法，該方法在恒溫63 ℃水浴鍋中作用60 min 即可完成整個(gè)反應(yīng)過(guò)程，檢測(cè)PRRSV、PPV、PRV、PCV2、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）均為陰性?？梢暬疞AMP 檢測(cè)方法除普通離心機(jī)和水浴鍋外，幾乎不需要其他設(shè)備，其檢測(cè)的敏感性和可靠性不低于傳統(tǒng)PCR 方法，非常適合應(yīng)用于豬場(chǎng)等條件簡(jiǎn)陋的基層實(shí)驗(yàn)室使用。

4.5 顯色原位雜交法

顯色原位雜交法（CISH）是近年來(lái)建立的一種新的顯色反應(yīng)與原位雜交相結(jié)合定位檢測(cè)技術(shù)，可以在光學(xué)顯微鏡下原位檢測(cè)目的基因擴(kuò)增結(jié)果，目前應(yīng)用比較廣泛的非放射性標(biāo)記物主要有生物素、地高辛和熒光染料。其中，用地高辛作標(biāo)記物的探針，其敏感性與放射性核素標(biāo)記的探針相似，是一種理想的非放射性探針標(biāo)記物。王占偉等[24]利用地高辛標(biāo)記豬肺炎支原體P36 基因核酸探針和DAB/H2O2顯色系統(tǒng)，建立了檢測(cè)豬肺炎支原體的顯色原位雜交研究方法，該方法檢測(cè)豬胸膜肺炎放線桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌2 型均為陰性，應(yīng)用該方法檢測(cè)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果低于常規(guī)PCR 檢測(cè)結(jié)果。顯色原位雜交法敏感性和特異性較高，并且直觀，為豬肺炎支原體的致病機(jī)理和檢測(cè)定位研究提供了一種技術(shù)手段和參考方法，但其敏感性有限。

4.6 間接ELISA 方法

間接ELISA 方法主要用于檢測(cè)抗體，首先用特異性抗原包被固相載體，依次加入含待測(cè)抗體的樣品和酶標(biāo)記的第二抗體，通過(guò)底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，顏色深淺與待測(cè)抗體量成正比。沈青春等[25]選擇豬肺炎支原體P46 膜蛋白基因親水區(qū)序列進(jìn)行克隆，并將其內(nèi)3 個(gè)編碼Trp 的TGA 突變成TGG，然后再克隆到pET28a 載體中，在大腸桿菌BL21 細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，將大腸桿菌表達(dá)的豬肺炎支原體P46重組蛋白經(jīng)過(guò)洗滌、過(guò)柱純化后，作為間接ELISA包被抗原，通過(guò)對(duì)各參數(shù)和試劑的優(yōu)化，建立了檢測(cè)豬肺炎支原體的間接ELISA 方法，該方法與IDEXX ELISA 試劑盒的陽(yáng)性符合率為84.2%，陰性符合率為91.4%，為豬肺炎支原體感染的抗體檢測(cè)提供了一種高通量、檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單的血清學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)。

4.7 雙抗夾心ELISA 方法

雙抗夾心ELISA 是將特異性抗體結(jié)合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢血清中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加酶標(biāo)記抗體，與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗原含量。田瑞雨等[26]以抗豬肺炎支原體P46 蛋白單克隆抗體為包被抗體，抗P46 蛋白多克隆抗體為檢測(cè)抗體，建立了豬肺炎支原體的雙抗體夾心ELISA 方法，該方法的重復(fù)性變異系數(shù)小于10%，最低檢出量為9.754 ng/mL，檢測(cè)豬鼻支原體、豬滑液支原體、絮狀支原體等均為陰性。雙抗夾心ELISA 具有良好的重復(fù)性、敏感性和特異性，為豬肺炎支原體感染的診斷和流行病學(xué)調(diào)查等提供一種高通量、檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單的血清學(xué)方法。

4.8 膠體金免疫層析方法

膠體金免疫層析法（GICA）是結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫技術(shù)、層析技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一種新型免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、快速、不需儀器設(shè)備、結(jié)果判斷直觀、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物疫病診斷尤其是基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)地診斷中得到了廣泛應(yīng)用。趙肖[27]通過(guò)檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，將其標(biāo)記豬肺炎支原體特異性抗原P46 蛋白作為金標(biāo)液并包被在玻璃纖維膜上，利用P46 蛋白包被檢測(cè)線，利用抗P46 蛋白單抗包被質(zhì)控線，建立了可用于豬肺炎支原體血清抗體檢測(cè)的膠體金免疫層析檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)PRRSV、PCV2、PRV、豬鼻支原體和豬滑液支原體等病原陽(yáng)性血清均為陰性，檢測(cè)豬肺炎支原體陽(yáng)性血清的最大稀釋倍數(shù)為1∶32，與商品化豬肺炎支原體ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒符合率為96.1%。膠體金免疫層析法無(wú)需特殊儀器設(shè)備、肉眼判讀，具有快速、靈敏、特異、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速診斷提供了新的模式，在基層獸醫(yī)單位具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

5 結(jié)語(yǔ)

現(xiàn)階段的感染現(xiàn)狀分析表明，豬肺炎支原體在我國(guó)豬群中呈全國(guó)性、散發(fā)性流行，其整體感染率一直居高不下，應(yīng)加強(qiáng)重視。對(duì)于豬支原體肺炎的各種實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，顯色原位雜交法對(duì)試驗(yàn)條件要求高、費(fèi)用成本高，且敏感性有限，適合致病機(jī)理和組織定位研究，不適合基層實(shí)驗(yàn)室快速診斷。LAMP 和膠體金方法檢測(cè)快速、對(duì)儀器設(shè)備要求較低，非常適合基層實(shí)驗(yàn)室使用，但敏感性太高，易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。PCR、巢式PCR、ELISA 方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、高通量，是目前豬肺炎支原體臨床診斷和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的主要方法，且巢式PCR 方法的敏感性比PCR 方法還要高，但PCR、巢式PCR 方法需使用溴化乙錠（EB）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生一定的威脅。熒光PCR 方法解決了PCR 方法的EB 污染問(wèn)題，且能夠定量檢測(cè)，但對(duì)儀器和操作人員技術(shù)水平要求較高，適合有條件的實(shí)驗(yàn)室使用。相信隨著豬肺炎支原體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，我國(guó)對(duì)豬肺炎支原體的不斷重視以及防控措施的不斷完善，豬支原體肺炎的感染也將會(huì)逐步得到控制，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)豬肺炎支原體的區(qū)域性凈化，并最終達(dá)到全國(guó)性凈化。