侯任達(dá)，張 潤，牛乃琪，楊 曼，黃曉宇，李慧慧，張龍超*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，晉中 030801)

在過去幾十年里瘦肉型豬在豬肉消費(fèi)市場中占有很大的份額，胴體瘦肉率在評價(jià)胴體品質(zhì)方面是一個(gè)非常重要的指標(biāo)，在胴體品質(zhì)相關(guān)的性狀中應(yīng)用廣泛[1-2]。然而育種場很難用大樣本來測定瘦肉率且豬胴體瘦肉率測定過程復(fù)雜，耗時(shí)長，成本高。因此，在實(shí)際的豬性能測定中一般采用其他相關(guān)性強(qiáng)的性狀來代替。何志平等[3]通過對杜×長二元雜交仔豬進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)瘦肉率與眼肌面積的相關(guān)系數(shù)為0.70，即瘦肉率與眼肌面積之間呈強(qiáng)相關(guān)。且通過眼肌面積來估測瘦肉率也可極顯著的降低成本[4]，所以在瘦肉豬的生產(chǎn)及選育工作中眼肌面積也是非常重要的指標(biāo)[5]。影響眼肌面積的主要因素包括營養(yǎng)(如飼料的蛋白質(zhì)含量)、環(huán)境、遺傳等[6-9]。而遺傳被廣泛認(rèn)為是眼肌面積發(fā)育的最重要因素，遺傳度在0.35～0.47之間[10-12]，表明這兩個(gè)性狀可以通過遺傳方法進(jìn)行改良。

遠(yuǎn)端上游元件結(jié)合蛋白屬于單鏈DNA結(jié)合家族，家族成員為FUBP1、FUBP2和FUBP3。FUBP3是一種蛋白質(zhì)編碼基因[13]。有研究表明，F(xiàn)UBP3可結(jié)合并促進(jìn)β-肌動(dòng)蛋白mRNA在成纖維細(xì)胞的定位[14]，且FUBP3與杜洛克豬的骨骼形成有關(guān)[15]。FUBP3是與豬肌肉發(fā)育和肉質(zhì)性狀相關(guān)的重要候選基因[16]，也是影響眼肌面積的候選基因[17]。泛素特異性蛋白酶(USPs)也稱去泛素酶，它是最大的泛素酶亞家族[18-19]。其成員USP43可識別并水解泛素C-末端甘氨酸處的肽鍵，參與多泛素前體及泛素化蛋白的加工[20]。Luo等[21]發(fā)現(xiàn)，USP43基因內(nèi)含子內(nèi)的SNP與多個(gè)肉品質(zhì)性狀顯著相關(guān)。

北京黑豬是20世紀(jì)60年代由大白、巴克夏和中國地方豬種雜交形成的地方豬種[22]，有著豐富的遺傳背景[23]。本研究通過對FUBP3和USP43基因進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測，并開展基因型與眼肌面積性狀(5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積)的關(guān)聯(lián)分析，以期為今后北京黑豬眼肌面積性狀的選育工作提供有效的分子輔助標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 組織樣品及表型數(shù)據(jù)收集

通過硫酸紙記錄408頭北京黑豬的5～6肋眼肌面積及最后肋眼肌面積輪廓，用聯(lián)想M700掃描儀以300像素進(jìn)行掃描，隨后用PS2020選中眼肌面積輪廓所得到的像素值除以標(biāo)準(zhǔn)像素值即可算出實(shí)際眼肌面積。其中北京黑豬中所有公豬均被閹割，母豬占比53%，公豬占比47%。屠宰隨著商業(yè)生產(chǎn)進(jìn)行，170～280日齡，動(dòng)物均飼養(yǎng)于北京黑六牧業(yè)科技有限公司。

1.2 DNA提取

用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)從組織樣品中提取基因組DNA，隨后通過超微分光光度計(jì)(IMPLEN)檢測其DNA濃度，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行DNA質(zhì)量評估并將質(zhì)量合格的DNA樣品放于-20 ℃保存。

1.3 RNA提取及cDNA的合成

對組織樣品進(jìn)行研磨，通過RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)按照說明書步驟進(jìn)行RNA提取，隨后通過超微分光光度計(jì)(IMPLEN)檢測其RNA 濃度。對于合格的RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)按說明書步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并對合格后的樣品保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

利用Primer Premier 5.0對FUBP3(NC_010443.5)、USP43(NC_010454.4)基因共設(shè)計(jì)43對引物，引物設(shè)計(jì)后由北京六合華大基因科技有限公司合成，部分引物見表1。

對408頭北京黑豬使用96孔板采用25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，聚合酶0.5 μL, DNA 1 μL，dNTP 0.5 μL,上、下游引物各 1 μL, RNase-free水 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，57～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京六合華大基因科技有限公司平臺(tái)進(jìn)行雙向Sanger測序。

表1 PCR引物信息

1.5 引物設(shè)計(jì)及熒光定量PCR

利用Primer Premier 5.0對FUBP3的 rs701769847G>A位點(diǎn)和USP43的 rs323463345G>A位點(diǎn)共設(shè)計(jì)2對引物，引物設(shè)計(jì)后由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物見表2。

取反轉(zhuǎn)錄后的cDNA，采用熒光定量試劑盒(TaKaRa TB Green)進(jìn)行定量。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，用FUBP3及USP43基因定量引物分別擴(kuò)增FUBP3和USP43的基因片段。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，20 μL反應(yīng)體系：2×qPCR Mix 10.4 μL，上下游引物共0.8 μL，cDNA 2 μL，RNase-free ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，30 s為模板的預(yù)變性階段；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)為模板的擴(kuò)增階段；60～95 ℃，以每10 s緩慢升溫0.5 ℃建立熔解曲線階段。

表2 RT-qPCR引物信息

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

將測序結(jié)果使用DNAStar中的SeqMan進(jìn)行比對分析，篩選突變個(gè)體的基因型。隨后利用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行各位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率的統(tǒng)計(jì)。使用SAS 9.4分析眼肌面積性狀(5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積)和基因型的關(guān)聯(lián)性，采用Duncan’s多重檢驗(yàn)用于評估不同基因型之間差異的顯著性，數(shù)據(jù)使用“最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05判定為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 表型數(shù)據(jù)整理

對408頭北京黑豬的5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)最后肋眼肌面積均值大于5～6肋眼肌面積。其中5～6肋眼肌面積均值為17.63 cm2，最大值為30.48 cm2,最小值為10.45 cm2。最后肋眼肌面積均值為31.41 cm2，最大值為49.15 cm2，最小值為19.64 cm2(表3)。

2.2 FUBP3和USP43基因多態(tài)性檢測及群體分布

通過對FUBP3及USP43基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后共發(fā)現(xiàn)15個(gè)突變位點(diǎn)(表4和表5)，分別位于啟動(dòng)子區(qū)、CDS和剪切區(qū)。其中FUBP3中有8個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域突變和1個(gè)同義突變；USP43基因中有1個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域突變，1個(gè)錯(cuò)義突變，1個(gè)剪切區(qū)突變和3個(gè)同義突變。這15個(gè)SNPs的基因型頻率變化范圍為1%～88%，其等位基因頻率變化范圍為6%～94%。

表3 5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積性狀的表型值統(tǒng)計(jì)

2.3 FUBP3、USP43基因多態(tài)性和眼肌面積性狀的關(guān)聯(lián)分析

將FUBP3和USP43基因通過PCR擴(kuò)增篩選的11個(gè)SNPs位點(diǎn)(FUBP3上8個(gè)啟動(dòng)子區(qū)突變；USP43上1個(gè)啟動(dòng)子區(qū)突變，1個(gè)錯(cuò)義突變，1個(gè)剪切區(qū)突變)與北京黑豬的5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積與基因型的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表6、表7。FUBP3的8個(gè)啟動(dòng)子區(qū)突變中rs701769847G>A與5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積都顯著關(guān)聯(lián)，rs325550799T>C、rs339464012T>C和rs326069041T>C與最后肋眼肌面積關(guān)聯(lián)顯著，與5～6肋眼肌面積關(guān)聯(lián)不顯著，rs332131528C>G與5～6肋眼肌面積顯著相關(guān)，與最后肋眼肌面積不相關(guān)，其余3個(gè)(rs335466858A>G、rs322433355C>A、rs346300986A>T)與5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積關(guān)聯(lián)均不顯著。在USP43上位于啟動(dòng)子區(qū)rs335310752C>T和剪切區(qū)突變r(jià)s323463345G>A與最后肋眼肌面積關(guān)聯(lián)顯著，與5～6肋眼肌面積關(guān)聯(lián)不顯著，錯(cuò)義突變 rs330703352A>G與5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積關(guān)聯(lián)均不顯著。

表4 北京黑豬FUBP3的基因型頻率及等位基因頻率統(tǒng)計(jì)

表5 北京黑豬USP43的基因型頻率及等位基因頻率統(tǒng)計(jì)

表6 FUBP3基因SNPs與5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積性狀的關(guān)聯(lián)分析

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

表7 USP43基因SNPs與5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積的關(guān)聯(lián)分析

2.4 FUBP3 rs701769847G>A位點(diǎn)和USP43 rs323463345G>A位點(diǎn)基因表達(dá)差異分析

根據(jù)rs701769847G>A位點(diǎn)基因型的不同分為眼肌面積較大的GG型和較小的AA型北京黑豬個(gè)體，隨后利用RT-qPCR技術(shù)檢測了FUBP3基因在4頭GG型個(gè)體和4頭AA型個(gè)體中的表達(dá)情況。定量結(jié)果顯示，AA基因型個(gè)體的FUBP3表達(dá)量顯著高于GG型個(gè)體(P<0.05)，見圖1。

根據(jù)rs323463345G>A位點(diǎn)基因型的不同分為眼肌面積較大的AA型和較小的GG型北京黑豬個(gè)體，隨后利用RT-qPCR技術(shù)檢測了USP43基因在3頭AA型和5頭GG型個(gè)體中的表達(dá)情況。定量結(jié)果顯示，USP43基因在GG型和AA型個(gè)體中差異不顯著，見圖2。

*. P<0.05。下同*. P<0.05. The same as below圖1 FUBP3基因相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression of FUBP3 gene

圖2 USP43基因相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression of USP43

3 討 論

眼肌面積在決定胴體瘦肉率方面起著重要作用[24]，且遺傳是影響眼肌面積最主要的因素[1]，所以在遺傳層面的研究是非常有必要的。Rohrer和Keele[25]研究發(fā)現(xiàn)，SSC1上的QTL對眼肌面積有顯著影響。有研究表明，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)SSC1上的FUBP3是影響眼肌面積性狀的候選基因[17]。Wang等[26]通過對中國青峪豬和長白豬進(jìn)行DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)FUBP3被鑒定為可能與肉質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因。FUBP3也有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，Brauckhoff等[27]研究發(fā)現(xiàn)FUBP3可加快肝癌細(xì)胞的增殖，且它在肝癌細(xì)胞中的高水平表達(dá)與患者存活率的下降顯著相關(guān)。FUBP3的結(jié)合基序(UAUA/UAUG)最近已被確定[28]，而該基序存在于β-actinmRNA 下游460 nt 的3′UTR，包含該基序的79 nt區(qū)域被FUBP3結(jié)合。Mukherjee等[14]研究也表明，F(xiàn)UBP3的敲除會(huì)導(dǎo)致β肌動(dòng)蛋白的增加。而β肌動(dòng)蛋白是肌肉細(xì)絲及細(xì)胞骨架微絲的主要成分，與細(xì)胞生長和細(xì)胞遷移有關(guān)[29-32]。根據(jù)上述報(bào)道推測，F(xiàn)UBP3可能通過調(diào)控β肌動(dòng)蛋白從而調(diào)控肌肉細(xì)胞的生長。本研究在北京黑豬群體中對FUBP3基因的8個(gè)位點(diǎn)與眼肌面積性狀(5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs701769847G>A位點(diǎn)與5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積都顯著相關(guān)，rs325550799T>C、rs339464012T>C和rs326069041T>C位點(diǎn)與最后肋眼肌面積顯著關(guān)聯(lián)，但與5～6肋眼肌面積相關(guān)不顯著，而rs332131528C>G位點(diǎn)與5～6肋眼肌面積關(guān)聯(lián)顯著，與最后肋眼肌面積關(guān)聯(lián)不顯著，rs335466858A>G、rs322433355C>A、rs346300986A>T位點(diǎn)則對5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積無顯著影響?；虮磉_(dá)差異分析表明，rs701769847G>A中FUBP3基因mRNA水平GG基因型個(gè)體顯著低于AA基因型個(gè)體(P<0.05)。

泛素特異性蛋白酶(USPs)在腫瘤形成和發(fā)展中具有重要作用。之前的研究表明，USP43在乳腺癌中是一種H2BK120脫泛素酶和潛在的腫瘤抑制因子，USP43和EGFR/PI3K/AKT之間相互抑制，從而抑制乳腺癌的發(fā)生[33]。此外，USP43可以通過調(diào)節(jié)乳腺癌的細(xì)胞周期和EMT過程來促進(jìn)腫瘤發(fā)生[34]。USP43基因在一些癌癥類型中高表達(dá)，如骨肉瘤[35]和結(jié)直腸癌[20]。許多USP成員參與肌肉的形成與發(fā)育[36]，比如USP15參與調(diào)節(jié)SLIM1的轉(zhuǎn)錄翻譯，從而調(diào)控心肌的肥大反應(yīng)，這在肌病和心肌病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[37]。USP14在骨骼肌萎縮的情況下可以被誘導(dǎo)到高水平[38]，USP2亞型的過量表達(dá)可以調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞的分化進(jìn)程[39]。USP19在嚙齒動(dòng)物萎縮肌肉中的mRNA表達(dá)量增加[40]，而USP19缺失會(huì)導(dǎo)致主要的肌原纖維蛋白水平增加[41]。雖然目前沒有文獻(xiàn)直接報(bào)道USP43對于肌肉發(fā)育形成的作用機(jī)制，但是已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)USP43基因也是影響多個(gè)肉品質(zhì)性狀(肌內(nèi)脂肪、大理石紋、水分，肉色等)的候選基因[21]。從而推測，USP43能促進(jìn)肌肉的生長發(fā)育。本研究在北京黑豬群體中對USP43基因的3個(gè)位點(diǎn)與眼肌面積性狀(5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs335310752C>T和rs323463345G>A與最后肋眼肌面積顯著關(guān)聯(lián)，與5～6肋眼肌面積相關(guān)不顯著。而rs330703352A>G與5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積均相關(guān)不顯著?；虮磉_(dá)差異分析表明，rs323463345G>A中GG和AA基因型個(gè)體的USP43基因mRNA水平差異不顯著。

4 結(jié) 論

通過使用408頭北京黑豬對FUBP3和USP43基因進(jìn)行多態(tài)性探索及與眼肌面積性狀關(guān)聯(lián)分析，共發(fā)現(xiàn)15個(gè)SNPs，其中FUBP3、USP43上共有2個(gè)位點(diǎn)與5～6肋眼肌面積顯著相關(guān)，6個(gè)位點(diǎn)與最后肋眼肌面積顯著相關(guān)，其中FUBP3 rs701769847G>A中FUBP3基因mRNA水平GG基因型個(gè)體顯著低于AA基因型個(gè)體(P<0.05)。以期探索調(diào)控性狀變異的候選基因功能位點(diǎn)，為進(jìn)一步闡釋性狀變異的遺傳機(jī)理奠定基礎(chǔ)。