王冰玉，鄭 凱，徐新云*，謝紅衛(wèi)*，于軍暉龍鼎新

(1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽(yáng)421001；2.深圳市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康所，廣東 深圳 518055)

2013年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)將室外空氣污染被歸類為一類致癌物質(zhì)，而室外空氣污染的主要成分——大氣顆粒物也被歸類為致癌物[1-2]。大氣細(xì)顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)是一種直徑≤2.5 μm的空氣污染物，其特點(diǎn)是粒徑小，表面積大，毒素吸收能力強(qiáng)[3-5]。作為國(guó)際公認(rèn)的致癌物PM2.5，其攜帶的多環(huán)芳烴和硝基化合物(如硝基-多環(huán)芳烴、3-硝基苯并蒽酮)被認(rèn)為是主要致癌化合物[6]。當(dāng)細(xì)胞的DNA損傷后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的癌變，細(xì)胞DNA修復(fù)不及時(shí)、不充分或修復(fù)錯(cuò)誤而進(jìn)入細(xì)胞周期，可發(fā)生DNA加合物形成、DNA單鏈斷裂、DNA雙鏈斷裂、堿基錯(cuò)配、脫堿基位點(diǎn)、堿基的插入或缺失等DNA損傷表現(xiàn)。有研究表明PM2.5可造成肺泡II型上皮細(xì)胞DNA損傷[7]，PM2.5暴露可引起ROS的產(chǎn)生和DNA損傷，影響胎兒的組織器官形成，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生[8]。為了深入探討PM2.5對(duì)DNA造成的損傷及其修復(fù)機(jī)制，本文以人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells，HBE)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用單細(xì)胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)檢測(cè)PM2.5致HBE細(xì)胞DNA損傷情況，熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)檢測(cè)PM2.5對(duì)HBE細(xì)胞DNA損傷修復(fù)基因mRNA表達(dá)影響，蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)DNA損傷修復(fù)基因的蛋白表達(dá)變化，為進(jìn)一步研究PM2.5對(duì)DNA氧化損傷和DNA損傷修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HBE細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)上海細(xì)胞庫(kù)，PM2.5樣品來(lái)源山西太原，K2CrO4購(gòu)于Sigma公司，胎牛血清(FBS)、0.25%Trpsin-EDTA購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司，SYBR PremixExTaq、PrimeScript RT reagent Kit和RNeasy Mini Kit購(gòu)于日本TaKaRa公司，hOGG1、hMTH1基因PCR引物由上海生工合成，hOGG1(ab124741)和hMTH1(ab-200832)抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，二抗抗體(羊抗兔IgG-HRP)購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司。單細(xì)胞凝膠電泳所需細(xì)胞裂解液、電泳緩沖液及中和液所需試劑，購(gòu)于上海生工公司；正常融點(diǎn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖，購(gòu)于美國(guó)BBI公司。倒置熒光顯微鏡和瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 PM2.5采集和樣品處理

實(shí)驗(yàn)用武漢天虹TH150F中流量采樣器和80 mm直徑的石英濾膜，按100 L/min的流量連續(xù)采樣，每天采樣24 h，由于山西太原是我國(guó)霧霾嚴(yán)重城市之一，所以PM2.5采樣地點(diǎn)在山西省太原市山西大學(xué)校園內(nèi)，采集時(shí)間為2018年12月。將吸附有PM2.5顆粒的石英濾膜剪成4小塊放入裝有超純水的燒杯中，用錫紙包住口，超聲振蕩30 min洗脫P(yáng)M2.5顆粒物，冷卻至室溫后放入-80℃冰箱。然后將樣品洗脫液真空冷凍干燥24 h后照紫外1 h，加入無(wú)菌水制備成PM2.5樣品儲(chǔ)備液，高壓滅菌后可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，使用前震蕩混勻。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒處理

HBE細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面積的70%～80%左右，將培養(yǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)懸液濃度，然后以5×105/mL的濃度接種到6孔板，每孔加2 mL DMEM完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿瓶底面積80%左右進(jìn)行PM2.5水溶液染毒處理。根據(jù)課題組前期進(jìn)行的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)使用PM2.5水溶液濃度分別是0(陰性對(duì)照組)、8、20、50 μg/mL，染毒24 h。DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)水平的檢測(cè)，采用PM2.5水溶液的終濃度分別為0、10和50 μg/mL，染毒24 h，以10 μmol/L的K2CrO4(以下用Cr6+表示)水溶液為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.4 單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)HBE細(xì)胞DNA損傷

使用上述方法將細(xì)胞培養(yǎng)與染毒后，預(yù)冷PBS洗2次，消化細(xì)胞，室溫3 000 r/min離心5 min，200 μL PBS重懸細(xì)胞。第1層膠用0.75%正常熔點(diǎn)瓊脂糖150 μL鋪于磨砂載玻片上，室溫下固化10 min；將20 μL細(xì)胞懸液與80 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的低熔點(diǎn)瓊脂糖充分混勻，迅速鋪第2層膠，4℃凝固約20 min，去掉蓋玻片，將載玻片浸入新鮮的冷細(xì)胞裂解液中，4℃靜置2 h。放入堿性電泳液中平衡20 min，然后在恒壓25 V、300 mA的條件下電泳25 min。取出玻片至中和液中和3次，每次5 min，晾干，碘化丙啶避光染色20 min。在熒光顯微鏡下，每片隨機(jī)觀察計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞并拍照，用彗星圖像分析軟件進(jìn)行分析，以尾部DNA百分率和尾長(zhǎng)作為綜合指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.5 PCR引物設(shè)計(jì)與合成

在Genbank上找到目的基因mRNA序列，用軟件選取CDS兩端的序列進(jìn)行分析，按照引物設(shè)計(jì)的原則確定qPCR上下游引物，目的基因熒光定量PCR引物見表1。委托上海生工公司按照表1合成qPCR上下游引物。

1.6 熒光定量PCR測(cè)定DNA損傷修復(fù)基因的mRNA表達(dá)水平

提取HBE細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，熒光定量PCR反應(yīng)按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明書步驟操作。各基因PCR引物委托上海生工公司合成，引物序列見表2。熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，55℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH的CT值為內(nèi)參，目的基因CT值采用 2-ΔΔCT

表1 目的基因熒光定量PCR引物

計(jì)算后的比值即為各基因的相對(duì)表達(dá)水平，此步驟由ABI7900HT分析軟件自動(dòng)計(jì)算并直接給出結(jié)果。

1.7 Western blot檢測(cè)DNA損傷修復(fù)基因的蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞染毒結(jié)束后，倒棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用冷PBS清洗3次，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，100℃變性8 min；用BCA法進(jìn)行蛋白定量。配制10%分離膠，5%濃縮膠，依次加入蛋白樣品；濃縮膠于80 V條件下電泳30 min，分離膠于120 V條件下電泳50 min。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)束后，按0.8 mA/cm2膠面積設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流，恒流轉(zhuǎn)膜100 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。根據(jù)各目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小，切取膜上相應(yīng)條帶，按抗體說(shuō)明書上的比例加入相應(yīng)的一抗后冰上孵育過(guò)夜；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。按1∶3 000比例稀釋HPR標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫下孵育1 h；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑后用冷CCD成像系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行曝光拍照，所得圖像用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)照組和PM2.5水溶液染毒組各指標(biāo)間差異的分析采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，LSD法進(jìn)行兩兩比較，以α=0.05為檢測(cè)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5水溶液染毒后HBE細(xì)胞DNA損傷情況

SCGE檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷情況見圖1～4，隨著PM2.5水溶液濃度的增加，HBE細(xì)胞DNA損傷程度逐漸加重，8.0 μg/mL組細(xì)胞DNA尾部DNA含量、尾長(zhǎng)、尾距與陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；20和50 μg/mL組細(xì)胞DNA百分含量、尾長(zhǎng)、尾距與陰性對(duì)照組相比顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。

圖1 熒光顯微鏡觀察PM2.5水溶液染毒后細(xì)胞DNA損傷的彗星圖像

圖2 PM2.5水溶液染毒細(xì)胞后SCGE檢測(cè)細(xì)胞尾部DNA含量

圖3 PM2.5水溶液染毒細(xì)胞后SCGE檢測(cè)細(xì)胞尾長(zhǎng)

圖4 PM2.5水溶液染毒細(xì)胞后SCGE檢測(cè)細(xì)胞尾距

2.2 PM2.5水溶液染毒后HBE細(xì)胞DNA損傷修復(fù)基因mRNA表達(dá)水平變化

qPCR檢測(cè)結(jié)果見圖5和圖6，與陰性對(duì)照組比較，hOGG1 mRNA在10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒以及陽(yáng)性對(duì)照Cr6+染毒后表達(dá)水平分別升高75.0%、132.0%、214.0%，hMTH1 mRNA在10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒以及Cr6+水溶液染毒后表達(dá)水平分別升高61.0%、144.0%、75.0%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

圖5 PM2.5對(duì)HBE細(xì)胞hOGG1 mRNA表達(dá)水平的影響

圖6 PM2.5對(duì)HBE細(xì)胞hMTH1 mRNA表達(dá)水平的影響

2.3 PM2.5水溶液染毒后HBE細(xì)胞hOGG1和hMTH1蛋白表達(dá)水平變化

Western blot結(jié)果見圖7，與陰性對(duì)照組比較，hOGG1蛋白在10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒和Cr6+染毒后表達(dá)水平分別升高47.6%、64.0%、47.0%，hMTH1蛋白在10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒以及Cr6+染毒后表達(dá)水平分別升高20.5%、49.8%、20.9%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

圖7 PM2.5染毒對(duì)HBE細(xì)胞hOGG1和hMTH1蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

本研究中，應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA損傷情況，表明PM2.5水溶液中劑量組20 μg/mL和高劑量組50 μg/mL對(duì)細(xì)胞DNA含量、尾長(zhǎng)、尾距有明顯影響，與陰性對(duì)照組比較顯著升高；進(jìn)一步用10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒HBE細(xì)胞，檢測(cè)DNA損傷修復(fù)基因hOGG1、hMTH1的mRNA和蛋白表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示10和50 μg/mL PM2.5水溶液均引起HBE細(xì)胞中hOGG1和hMTH1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于陰性對(duì)照組；差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。這些結(jié)果提示，PM2.5對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞DNA具有明顯的損傷作用。

大量的流行病學(xué)研究表明，空氣污染對(duì)人體健康存在嚴(yán)重危害[9-10]。DNA作為機(jī)體的主要遺傳物質(zhì)，其穩(wěn)定性對(duì)機(jī)體的作用至關(guān)重要，PM2.5中的各種有害物質(zhì)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后，在體內(nèi)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)。ROS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和DNA損傷，可導(dǎo)致DNA雙鏈斷鏈[11]?？僧a(chǎn)生不同程度的致畸、致癌、致突變遺傳毒性，增加罹患惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)以及畸胎的發(fā)病率[12]。由于PM2.5通過(guò)人體呼吸首先進(jìn)入肺部，對(duì)呼吸系統(tǒng)影響毋庸置疑，所以本文選取的人支氣管上皮細(xì)胞HBE，HBE是永生化人支氣管細(xì)胞系[13]，仍保持人支氣管上皮細(xì)胞及非致瘤性特征。

鳥嘌呤的氧化還原電位較低，因此最易受到ROS的攻擊形成8-氧鳥嘌呤(8-oxo G)及8-氧脫氧鳥苷三磷酸(8-oxo-d GTP)，8-oxo-dG是一種主要的DNA氧化損傷產(chǎn)物，可在DNA復(fù)制中通過(guò)G→T或A→C堿基顛換導(dǎo)致DNA誤讀。8-oxo-d GTP在復(fù)制過(guò)程中可插入到DNA鏈中與堿基反應(yīng)形成8-oxo G。如果未及時(shí)處理8-oxo G，就會(huì)在DNA復(fù)制過(guò)程中造成G：C→T：A顛倒突變。人8-氧鳥嘌呤DNA糖苷酶1(hOGG1)及MutT同源酶即人8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶(hMTH1)是機(jī)體內(nèi)修復(fù)8-oxo G的主要工具酶。hMTH1主要負(fù)責(zé)核苷酸池中8-OH-GTP的清除，hOGG1主要負(fù)責(zé)DNA中對(duì)8-oxo-dG的修復(fù)，防止G：C→T：A顛倒突變，其共同作用與DNA損傷修復(fù)關(guān)系密切，能有效地檢測(cè)并定量分析細(xì)胞中DNA單雙鏈缺口損傷的程度，所以本文選擇檢測(cè)這兩個(gè)基因的表達(dá)水平。單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典的檢測(cè)DNA鏈損傷來(lái)判別遺傳毒性的技術(shù)[14]，通過(guò)測(cè)定DNA遷移部分的光密度或遷移長(zhǎng)度就可以測(cè)定單個(gè)細(xì)胞DNA損傷程度，從而確定受試物的作用劑量與DNA損傷效應(yīng)的關(guān)系。該方法檢測(cè)低濃度遺傳毒性具有高靈敏性，研究的細(xì)胞不需處于有絲分裂期，同時(shí)這種技術(shù)需要的細(xì)胞數(shù)較少[15]。

鑒于目前大氣污染與肺癌發(fā)病存在密切關(guān)系，為了深入研究環(huán)境污染物致癌的分子毒理學(xué)機(jī)制，本文采用PM2.5染毒HBE細(xì)胞，研究PM2.5對(duì)DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)的影響，探討PM2.5對(duì)細(xì)胞DNA損傷作用，對(duì)于今后進(jìn)一步研究環(huán)境污染物和霧霾的健康危害，具有一定的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。