王 倩，黃云飛，雷 磊，蘇德奇*

(新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理教研室，新疆烏魯木齊 830001)

大量流行病學(xué)研究證明，高度或長(zhǎng)期的精神緊張會(huì)導(dǎo)致高血壓、肥胖、焦慮、抑郁等諸多疾病[1]。中國(guó)是世界上最大的煙草消費(fèi)國(guó)，吸煙者總數(shù)達(dá)到3.01億，每年因煙草死亡的人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)，約占全國(guó)死亡人數(shù)的12%[2-3]。煙草濫用問(wèn)題早已受到關(guān)注，有研究顯示，緊張會(huì)誘發(fā)個(gè)體對(duì)香煙的渴求，經(jīng)常處于緊張狀態(tài)的人群吸煙率較高，增加煙草使用的危險(xiǎn)性，從而影響人體健康[4]。近年來(lái)對(duì)吸煙及緊張狀態(tài)的研究大多集中在對(duì)暴露于單一因素的研究[5-6]，二者聯(lián)合作用對(duì)學(xué)習(xí)和記憶能力影響的研究較少，即吸煙與緊張狀態(tài)聯(lián)合對(duì)機(jī)體的危害是否存在交互作用，其作用形式值得深入探討。膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)參與學(xué)習(xí)和記憶等相關(guān)的重要生理活動(dòng)[7]。因此本研究采用2×2析因設(shè)計(jì)，對(duì)大鼠進(jìn)行香煙煙霧、慢性應(yīng)激單獨(dú)及聯(lián)合暴露，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，觀察大鼠學(xué)習(xí)和記憶行為，測(cè)定大鼠血清中皮質(zhì)醇(cortisol，Cort)、乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyl transferase，ChAT)濃度和乙酰膽堿脂酶(acetylcholinesterase，AchE)活力以評(píng)價(jià)香煙煙霧和慢性應(yīng)激聯(lián)合對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用形式，探討香煙煙霧和慢性應(yīng)激聯(lián)合作用對(duì)大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Cort Elisa試劑盒，生產(chǎn)批號(hào)201904，購(gòu)于上海雨朵生物科技有限公司；ACH、CHAT Elisa試劑盒，生產(chǎn)批號(hào)201905，購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；ACHE試劑盒，生產(chǎn)批號(hào)20190516，購(gòu)于南京建成生物化學(xué)試劑有限公司。

恒溫水浴鍋HH-501型，購(gòu)于常州萬(wàn)合儀器制造有限公司；UV-2501PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)于日本Shimadzu公司；Benchmark PLUS型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，購(gòu)于BIO-RAD公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及受試物

SPF級(jí)SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量80～120 g，供應(yīng)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(新)2016-0002。受試物為某品牌過(guò)濾嘴香煙，焦油含量18 mg，煙氣煙堿含量1.1 mg。

1.3 動(dòng)物分組及動(dòng)物模型制作

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后(室溫控制在22～25℃，相對(duì)濕度保持在55%～65%，普通喂養(yǎng))，按照2×2析因設(shè)計(jì)隨機(jī)分為對(duì)照組、香煙煙霧組、慢性應(yīng)激組、聯(lián)合干預(yù)組，每組10只，雌雄各半，見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物分組

對(duì)照組大鼠不做任何處理。香煙煙霧組進(jìn)行呼吸道靜式染毒，把大鼠放進(jìn)40 L的染毒箱內(nèi)，燃燒香煙，讓香煙充分進(jìn)入染毒箱內(nèi)，每天1次，每次10支，每次1 h；慢性應(yīng)激組通過(guò)慢性應(yīng)激模擬人的緊張，根據(jù)文獻(xiàn)[8-9]進(jìn)行調(diào)整，包括雙下肢束縛倒吊、噪音、夾尾、熱蒸汽熏浴、冷水浴5種慢性應(yīng)激方式，每天隨機(jī)給予1種應(yīng)激方式，每種慢性應(yīng)激方式不連續(xù)應(yīng)用，預(yù)防實(shí)驗(yàn)大鼠產(chǎn)生適應(yīng)性；聯(lián)合干預(yù)組同時(shí)暴露于香煙煙霧和慢性應(yīng)激中，大鼠每日先按照慢性應(yīng)激組處理，后按香煙煙霧組方法進(jìn)行，4組暴露時(shí)間均為12周，每隔兩周稱重并記錄。

利用血清皮質(zhì)醇濃度來(lái)確定慢性應(yīng)激模型的成功建立[10]。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理及腦的臟器系數(shù)測(cè)定

12周染毒結(jié)束后，斷食24 h，各組大鼠稱重并記錄，麻醉后處死，腹主動(dòng)脈采血，血樣于4℃、1 500 r/min離心15 min，取上清，于-80°冰箱保存；迅速取出腦組織，稱取腦質(zhì)量并計(jì)算腦的臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)重×100%)。

1.5 病理學(xué)觀察

切下大鼠右腦組織并置于4%多聚甲醛中進(jìn)行固定24～48 h，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色及封片，顯微鏡觀察腦組織神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞核變化并拍照。

1.6 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

分別于染毒2、4、8、10、12周時(shí)，采用水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)4組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測(cè)。水中放入奶粉使其變?yōu)槿榘咨?，將大鼠任意從四個(gè)象限之一面向池壁放入水中，記錄大鼠逃避潛伏期，即大鼠爬上站臺(tái)并保持10 s所需時(shí)間，若大鼠120 s未找到站臺(tái)，則記錄為120 s，每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行1 d。

1.7 血清中指標(biāo)測(cè)定

采用相應(yīng)試劑盒測(cè)定大鼠血清中ACHE活力，采用相應(yīng)Elisa試劑盒檢測(cè)大鼠血清中Cort、ACH、CHAT含量，各實(shí)驗(yàn)步驟均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 24.0軟件分析，計(jì)量資料用xˉ±s描述；組間比較用單因素方差分析；交互作用評(píng)價(jià)用析因設(shè)計(jì)方差分析；以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠應(yīng)激模型的確認(rèn)

與對(duì)照組比較，慢性應(yīng)激組大鼠Cort濃度顯著增加(P＜0.05)，表明慢性應(yīng)激組大鼠處于緊張狀態(tài)，提示模型建立成功，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠Cort檢測(cè)結(jié)果(n=10，x±s)

2.2 大鼠體質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，香煙煙霧、慢性應(yīng)激及聯(lián)合干預(yù)組大鼠體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，聯(lián)合暴露對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響不存在交互作用(P＞0.05)，見(jiàn)表3和表4。

表3 各組大鼠體質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果(n=10，x±s，g)

表4 大鼠體質(zhì)量析因設(shè)計(jì)資料的方差分析結(jié)果

表5 各組大鼠腦質(zhì)量及腦臟器系數(shù)結(jié)果(n=10，x±s)

2.3 大鼠腦質(zhì)量及臟器系數(shù)結(jié)果

與對(duì)照組比較，香煙煙霧、慢性應(yīng)激及聯(lián)合干預(yù)組大鼠腦質(zhì)量及腦臟器系數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，聯(lián)合對(duì)大鼠腦質(zhì)量及腦的臟器系數(shù)的影響均不存在交互作用(P＞0.05)，見(jiàn)表5和表6。

2.4 大鼠腦組織病理觀察結(jié)果

各組大鼠腦組織經(jīng)HE染色后的病理形態(tài)見(jiàn)圖1，對(duì)照組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，核膜邊緣清晰，核仁明顯，結(jié)構(gòu)清晰完整。香煙煙霧組大鼠神經(jīng)元可見(jiàn)輕度核固縮，腦膜血管中度充血及輕度出血，膠質(zhì)細(xì)胞增生。慢性應(yīng)激組大鼠神經(jīng)元可見(jiàn)輕度核固縮及輕度淤血。聯(lián)合干預(yù)組大鼠神經(jīng)元可見(jiàn)中度核固縮，腦膜輕度淤血及水腫，神經(jīng)元周圍可見(jiàn)空泡形成。

表6 大鼠腦質(zhì)量及腦臟器系數(shù)析因設(shè)計(jì)資料的方差分析結(jié)果

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)觀察結(jié)果(HE染色，10×20)

2.5 大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與對(duì)照組比較，第4、8周慢性應(yīng)激組逃避潛伏期明顯增加(P＜0.05)，第10周二者單獨(dú)及聯(lián)合干預(yù)組逃避潛伏期均明顯增加(P＜0.05)，且聯(lián)合干預(yù)組逃避潛伏期最長(zhǎng)；與慢性應(yīng)激組比較，第2周聯(lián)合干預(yù)組逃避潛伏期顯著減少(P＜0.05)，香煙煙霧與慢性應(yīng)激聯(lián)合暴露存在交互作用(P＜0.05)，交互作用呈拮抗作用(P＜0.05)，見(jiàn)表7和表8。

表7 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期結(jié)果(n=10，x±s)

表8 大鼠逃避潛伏期析因設(shè)計(jì)資料的方差分析結(jié)果

2.6 大鼠血清ACH、CHAT含量及ACHE活力

與對(duì)照組比較，香煙煙霧、慢性應(yīng)激單獨(dú)及聯(lián)合干預(yù)組大鼠ACH含量明顯降低(P＜0.05)，慢性應(yīng)激組ACHE活力升高、CHAT含量降低(P＜0.05)；香煙煙霧與慢性應(yīng)激聯(lián)合暴露對(duì)ACH、CHAT含量及ACHE活力均無(wú)交互作用(P＞0.05)，見(jiàn)表9和表10。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激可導(dǎo)致下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸激活，從而引起糖皮質(zhì)激素(GC)分泌升高，造成機(jī)體損傷和疾病[10]。近年來(lái)，在與慢性應(yīng)激相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常將皮質(zhì)醇濃度升高作為慢性應(yīng)激模型建立成功的標(biāo)志[11]。本次研究結(jié)果顯示，慢性應(yīng)激組Cort濃度升高，提示慢性應(yīng)激模型建立成功。本次研究表明，聯(lián)合干預(yù)組的大鼠體質(zhì)量、腦重量及腦臟器系數(shù)與對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未發(fā)現(xiàn)存在交互作用，提示在本次實(shí)驗(yàn)條件和觀察期內(nèi)，香煙煙霧和慢性應(yīng)激對(duì)大鼠生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)明顯影響。

表9 各組大鼠ACH、ACHE、CHAT結(jié)果(n=10，x±s)

表10 大鼠ACH、ACHE、CHAT析因設(shè)計(jì)資料的方差分析結(jié)果

Morris水迷宮是研究學(xué)習(xí)記憶能力最常用的工具之一，是目前檢測(cè)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的最佳工具[12]。本次研究的水迷宮結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第2周時(shí)，香煙煙霧與慢性應(yīng)激聯(lián)合干預(yù)組的逃避潛伏期明顯減少，呈拮抗作用，提示在本實(shí)驗(yàn)條件下，短期內(nèi)(2周左右)二者聯(lián)合進(jìn)入機(jī)體下可能相互抑制。第10周，香煙煙霧、慢性應(yīng)激單獨(dú)及聯(lián)合干預(yù)組大鼠逃避潛伏期明顯高于對(duì)照組，表明長(zhǎng)期(10周左右)的香煙煙霧與慢性應(yīng)激單獨(dú)及聯(lián)合暴露均會(huì)導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降，與葛曉東[13]、吳紅芳[14]等的研究一致；此外，第10周開(kāi)始聯(lián)合干預(yù)組的逃避潛伏期最長(zhǎng)，HE染色結(jié)果也表示聯(lián)合干預(yù)組對(duì)腦組織造成的影響最大，提示長(zhǎng)時(shí)間(10周左右)的聯(lián)合暴露后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力損傷最嚴(yán)重。

ACH作為腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與中樞膽堿能系統(tǒng)密切相關(guān)，在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中起著重要作用，當(dāng)其水平發(fā)生變化時(shí)，學(xué)習(xí)記憶能力也會(huì)隨之改變。ACH是一種由ACHE水解而成的酶，CHAT是參與ACH合成的關(guān)鍵膽堿能標(biāo)記物，二者共同維持ACH的動(dòng)態(tài)平衡,與ACH的合成有密切關(guān)系[15-16]。袁圣楠[17]發(fā)現(xiàn)在大鼠學(xué)習(xí)記憶受損的過(guò)程中，腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿含量降低。本次研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧、慢性應(yīng)激單獨(dú)及聯(lián)合干預(yù)組大鼠ACH含量顯著降低，這與以往學(xué)習(xí)記憶相關(guān)研究結(jié)果一致[18]。慢性應(yīng)激組ACHE活力升高、CHAT含量降低，而香煙煙霧組CHAT含量及ACHE活力變化并不明顯，提示大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降主要是通過(guò)造成ACH含量降低來(lái)實(shí)現(xiàn)的。析因分析結(jié)果顯示，香煙煙霧和慢性應(yīng)激聯(lián)合干預(yù)對(duì)大鼠血清中ACH、CHAT含量及ACHE活力的影響均不存在交互作用，因此尚不能認(rèn)為香煙煙霧和慢性應(yīng)激聯(lián)合暴露比單獨(dú)暴露更容易對(duì)大鼠血清中ACH、CHAT含量及ACHE活力產(chǎn)生影響。

綜上所述，香煙煙霧和慢性應(yīng)激聯(lián)合暴露在第2周時(shí)，對(duì)大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力產(chǎn)生拮抗作用；第10周之后二者單獨(dú)及聯(lián)合暴露均會(huì)引起大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，聯(lián)合暴露組損傷最嚴(yán)重；二者單獨(dú)及聯(lián)合暴露主要通過(guò)造成ACH合成受損，導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降，聯(lián)合暴露對(duì)ACH、CHAT含量及ACHE活力的影響未產(chǎn)生交互作用；香煙煙霧和慢性應(yīng)激聯(lián)合暴露的作用形式并非不變，而會(huì)因暴露時(shí)間、檢測(cè)指標(biāo)的不同而改變，具體作用機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。