徐賢榮，楊 軍*

(杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，浙江 杭州 310036)

旁斑蛋白組成成分1(paraspeckles protein component 1，PSPC1/PSP1)是一種新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞核內(nèi)核旁斑點(paraspeckle)結(jié)構(gòu)蛋白，屬于果蠅行為/人類剪接蛋白家族(drosophila behavior/human splicing，DBHS)。PSPC1與DBHS蛋白家族其他兩個成員，含八聚體結(jié)合蛋白的非POU結(jié)構(gòu)域(non-POU-domain-containing octamer binding protein，NONO)和富含脯氨酸/谷氨酰胺的剪接因子(splicing factor proline/glutamine rich，SFPQ/PSF)，以及長鏈非編碼RNA NEAT 1共同構(gòu)成了旁斑結(jié)構(gòu)。DBHS家族蛋白幾乎參與細(xì)胞基因調(diào)控的每一步，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA加工和轉(zhuǎn)運、DNA修復(fù)等過程。盡管DBHS蛋白作為一個整體已經(jīng)被證明具有重要的生物學(xué)功能，但有關(guān)PSPC1的相關(guān)研究仍處于起步階段，其具體生物學(xué)功能依然有許多不明確的地方。本文就PSPC1的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 PSPC1的發(fā)現(xiàn)

2002年，F(xiàn)ox等應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)對細(xì)胞核蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了271種蛋白，其中80種蛋白由未知功能的基因所編碼[1]。其中，有一種蛋白在染色質(zhì)間隙的核旁斑點中聚集，被命名為PSPC1。他們發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用放線菌素D(actinomycin D)抑制RNA轉(zhuǎn)錄的情況下，PSPC1在細(xì)胞核內(nèi)聚集，這引起了他們的興趣，從而對其進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。在放線菌素D處理細(xì)胞后，熒光素標(biāo)記的PSPC1蛋白信號在核質(zhì)中逐漸消失，而在核仁帽狀結(jié)構(gòu)中開始出現(xiàn)。由于核旁斑點本身沒有出現(xiàn)位置變化，作者認(rèn)為PSPC1蛋白是從核旁斑點中逸出后在核內(nèi)單獨聚集，可能參與細(xì)胞核內(nèi)重要的生物學(xué)功能[2]。PSPC1的發(fā)現(xiàn)及其在細(xì)胞基因調(diào)控中的表現(xiàn)引起了人們的關(guān)注，從而開展了與之有關(guān)的相關(guān)研究。

2 PSPC1的結(jié)構(gòu)

PSPC1由532個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為5.82×104，含有兩個異構(gòu)體，分別稱之為PSPC1-α和PSPC1-β。PSPC1在哺乳動物中高度保守，人類與小鼠的同源性高達(dá)95%[1]。和所有的DBHS家族蛋白一樣，PSPC1具有一段300個氨基酸左右長度的高度保守序列，包含兩個串聯(lián)的N-末端RNA識別區(qū)域(RNA recognition motifs，RRMs)，一個含52個氨基酸的非腺苷酸/旁斑區(qū)域(nonA/paraspeckle domain，NOPS)和一個約100個氨基酸的C-末端卷曲螺旋(圖1)。RRMs是高等脊椎動物中最為豐富的RNA結(jié)合域(在人類中占基因總量的0.5%～1%)，典型的RRM包含約90個氨基酸序列，兩個RRM之間由7個彈性氨基酸序列所串聯(lián)[3]。其中RRM1結(jié)構(gòu)較為固定，由4個芳香族氨基酸殘基構(gòu)成，形成β1α1β2β3α2β4拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，為重要的RNA結(jié)合區(qū)域；RRM2中則4個保守的氨基酸殘基分別被蘇氨酸，賴氨酸和異亮氨酸所取代，在3環(huán)和5環(huán)上形成額外的β折疊；其中的一個具有高度保守序列，代表一個雙鏈DNA/RNA識別區(qū)域，提示其結(jié)合RNA的能力較差或者結(jié)合的形式較為特殊。RRMs上的這些殘基對于DBHS蛋白相互作用，并參與形成旁斑的過程發(fā)揮關(guān)鍵的作用。NOPS區(qū)域自RRM2末端延伸出來，連接卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，參與PSPC1與其他DBHS蛋白之間二聚體的形成，其表面的堿性氨基酸殘基也可與核酸相結(jié)合。C末端的卷曲螺旋為高度有序序列，能夠形成二聚體或寡聚體，在形成二聚體時，呈現(xiàn)右旋反并聯(lián)結(jié)構(gòu)。

圖1 PSPC1二級結(jié)構(gòu)示意圖

3 PSPC1生物活性形式

PSPC1最初作為旁斑結(jié)構(gòu)的組分，是旁斑的標(biāo)志之一。在形成旁斑過程中，以一種長鏈非編碼RNA——NEAT1作為骨架，招募PSPC1和其他DBHS蛋白(NONO和PSF/SFPQ)結(jié)合于其上。在旁斑結(jié)構(gòu)中，PSPC1、NONO和PSF/SFPQ能夠結(jié)合到特定mRNA腺苷(A)-I(肌酐)反向重復(fù)發(fā)卡樣序列上，將這些RNA滯留在細(xì)胞核內(nèi)，并在旁斑結(jié)構(gòu)中接受編輯。

PSPC1以二聚體或與其他DBHS蛋白形成異二聚體形式發(fā)揮作用，其中異二聚體的穩(wěn)定性大于二聚體(圖2)。PSPC1與NONO或PSF/SFPQ均能夠形成異二聚體結(jié)構(gòu)，在小鼠睪丸支持細(xì)胞中已經(jīng)觀察到3種蛋白之間形成的異二聚體[4]。二聚體的形成，不僅對于PSPC1結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要，還決定其生物學(xué)功能的發(fā)揮。Passon等在2011年首次觀察到了PSPC1-NONO異二聚體結(jié)晶[5]，并在后續(xù)的研究中對其結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行了詳細(xì)的闡述[6]。PSPC1-NONO異二聚體以右旋反向螺旋結(jié)構(gòu)形式存在，4個RNA識別結(jié)構(gòu)區(qū)域每兩個分別在兩側(cè)形成一個20埃的通道樣結(jié)構(gòu)。形成二聚體的過程中，70%的縮合結(jié)構(gòu)位于C末端，形成假性的對稱結(jié)構(gòu)。相反，在N末端兩個RMM1區(qū)域出現(xiàn)了斷裂，呈現(xiàn)相互疊加。兩個分子中，25%親水性的結(jié)構(gòu)在形成二聚體的過程中分解，每個單倍體43%的殘基直接參與二聚體相互作用界面的形成。蛋白相互作用面延伸至整個蛋白上，4個部分均參與其中。由于在相互作用過程中，兩者發(fā)生分解和重構(gòu)，在體內(nèi)無法獨立穩(wěn)定存在，可能為特異性異二聚體[7]。此外，界面間隙表明這種結(jié)構(gòu)僅僅是過渡性的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用形式[7]，說明這種二聚體存在相互交換的動態(tài)過程。這種交換在無脊椎動物DBHS蛋白的進(jìn)化過程中持續(xù)存在，通過組成不同的二聚體或異二聚體從而不斷增加DBHS蛋白的功能。

Huang等人在新近的研究中明確了PSPC1-SFPQ異二聚體的晶體結(jié)構(gòu)[8]。與以前發(fā)現(xiàn)的DBHS蛋白相互作用結(jié)構(gòu)類似，由于兩者序列之間高度的相似性(74%相同，93%類似)，PSPC1-SFPQ異二聚體呈現(xiàn)一個假性對稱結(jié)構(gòu)。RRM2、NOPS和卷曲螺旋組成了相互作用的主要部分。由于天然的高度疏水性，三者形成相互作用面在兩個蛋白之間形成右旋的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白超過40%的殘基參與相互作用面的形成，主要通過疏水鍵維持這種結(jié)構(gòu)。PSPC1-SFPQ異二聚體的結(jié)合力是SFPQ二聚體的10倍，是NONO-SFPQ二聚體的6倍。

圖2 PSPC1的3種二聚體形式和結(jié)構(gòu)[9]

4 PSPC1的生物學(xué)功能

最初，PSPC1很大程度上作為旁斑的特異性標(biāo)志物被人們所認(rèn)識，但又不是旁斑形成的必要條件，其具體作用并不清楚。后續(xù)的研究陸續(xù)證明，PSPC1可能在其他方面發(fā)揮重要作用，包括DNA損傷修復(fù)，細(xì)胞分化和周期調(diào)控，癌癥的發(fā)生與發(fā)展，神經(jīng)退行性疾病等。

4.1 參與細(xì)胞DNA損傷修復(fù)

DBHS蛋白能夠參與DNA雙鏈斷裂(double-stranded break，DSB)修復(fù)，其類型包括同源定向修復(fù)或非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)。研究發(fā)現(xiàn)，PSF/SFPQ在多種細(xì)胞中均具有促進(jìn)同源DNA配對，互補寡核苷酸侵入超螺旋DNA，D-環(huán)形成和加強拓?fù)洚悩?gòu)酶活性的作用。SFPQ/NONO復(fù)合物能夠結(jié)合Ku蛋白和底物DNA[10]，并直接與RAD51[11]，TopBP1[12]，和Matrin3[13]相互作用，將蛋白質(zhì)募集到DNA損傷位點[14]，大大加快同源和非同源修復(fù)速度。當(dāng)NONO缺乏的情況下，細(xì)胞內(nèi)PSPC1蛋白出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，并與PSF/SFPQ形成穩(wěn)定的復(fù)合物，替代NONO的功能，參與細(xì)胞DNA修復(fù)過程。在NONO缺陷的背景下，敲除PSPC1將會導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)高度的放射敏感性和DNA損傷修復(fù)延遲，表明PSPC1參與DNA損傷修復(fù)過程[15]。

Wu等對PSPC1在DNA損傷修復(fù)中的作用進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞DNA損傷后，細(xì)胞中PSPC1出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，說明PSPC1可能參與DNA損傷過程[16]。采用siRNA技術(shù)下調(diào)細(xì)胞PSPC1表達(dá)后，細(xì)胞生長顯著受到抑制，自發(fā)凋亡增加，DNA損傷加重。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PSPC1并不與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白，包括γH2AX、53BP1或Rad51共定位，表明其可能不直接參與DNA損傷修復(fù)過程[17]。分析其分子機制發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞PSPC1表達(dá)下調(diào)時，細(xì)胞逃脫了G1/S相檢驗點，更多的細(xì)胞進(jìn)入G2/M相，導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)障礙，引起更多細(xì)胞出現(xiàn)凋亡[17]。在甲磺酸甲酯誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷中同樣發(fā)現(xiàn)，敲除PSPC1將使得更多細(xì)胞逃脫G1/S檢驗點，進(jìn)入G2/M相，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)有絲分裂災(zāi)難，加重細(xì)胞凋亡；高表達(dá)PSPC1則能夠使更多細(xì)胞停滯在G1/S相[18]。以上結(jié)果表明，PSPC1更可能是參與G1/S檢驗點調(diào)控的一個重要分子，在DNA損傷的情況下被誘導(dǎo)高表達(dá)，進(jìn)而激活G1/S檢驗點，使得細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞得以對DNA損傷進(jìn)行修復(fù)；而當(dāng)其被抑制時，G1/S檢驗點無法被激活，損傷的DNA無法得到修復(fù)并進(jìn)入到G2/M期，最終導(dǎo)致死亡[18]。其課題組還通過蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫共沉淀的方法分析了PSPC1調(diào)控細(xì)胞周期的機制，發(fā)現(xiàn)PSPC1能夠與調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白質(zhì)——ATP互作蛋白(ATR-interacting protein，ATRIP)之間發(fā)生相互作用，提示PSPC1可能通過該機制發(fā)揮其生物學(xué)功能(待發(fā)表)。

4.2 其他功能

4.2.1 調(diào)控DNA甲基化修飾Guallar等研究發(fā)現(xiàn)，PSPC1能夠與DNA甲基化修飾作用密切相關(guān)的蛋白——10-11易位蛋白2(Ten-eleven translocation protein 2，TET2)相互結(jié)合，將其招募到染色體上。PSPC1和TET2通過組蛋白脫乙?；傅霓D(zhuǎn)錄抑制和通過5-羥甲基胞嘧啶修飾的RNA的轉(zhuǎn)錄后去穩(wěn)定化，促進(jìn)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒關(guān)的基因調(diào)控過程[19]。

4.2.2 補償NONO功能DBHS蛋白家族中的NONO蛋白是多種生命活動中的關(guān)鍵分子，調(diào)控細(xì)胞周期節(jié)律、DNA損傷修復(fù)以及神經(jīng)細(xì)胞功能完整。在缺失NONO蛋白的情況下，其功能在一定程度上由PSPC1進(jìn)行補償。Li等人研究發(fā)現(xiàn)，在DNA修復(fù)過程中，敲除NONO之后，PSPC1表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，并與SFPQ形成功能性異二聚體，補償NONO的功能，從而完成DNA的修復(fù)過程[15]。Ha等人發(fā)現(xiàn)，在DNA損傷過程中，當(dāng)NONO數(shù)量不足的情況下，PSF能夠誘導(dǎo)PSPC1共定位到DNA損傷部位，促進(jìn)DNA修復(fù)過程，而在NONO數(shù)量充足的情況下不直接參與DNA修復(fù)[14]。

Yamamoto等人也發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌細(xì)胞系——LNCaP-SF中，沉默NONO表達(dá)后，PSPC1表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)[20]。然而，PSPC1對于NONO的一些特殊功能可能沒有補償作用，如在小鼠中敲除NONO導(dǎo)致的行為異常，以及人體中NONO基因缺陷導(dǎo)致的智力障礙[21]。

4.2.3 參與癌癥形成研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌組織中，PSPC1表達(dá)下調(diào)[22]。Silva等研究發(fā)現(xiàn)，一種多腺苷酸化長期應(yīng)激誘導(dǎo)的長鏈非編碼RNA——LSINCT5在乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞中出現(xiàn)過度表達(dá)。下調(diào)其在細(xì)胞中的表達(dá)后，細(xì)胞增殖出現(xiàn)抑制，其中PSPC1基因也出現(xiàn)了顯著的下調(diào)[23]。在乳腺癌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，采用二甲雙胍處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)PSPC1表達(dá)水平與細(xì)胞對二甲雙胍反應(yīng)性密切相關(guān)，提示PSPC1參與癌細(xì)胞代謝過程中[24]。對結(jié)腸癌細(xì)胞核蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞相比，PSPC1蛋白表達(dá)量顯著提高[25]。在結(jié)腸癌患者中，其癌組織PSPC1蛋白表達(dá)豐度與臨床結(jié)局密切相關(guān)。

Yeh等人在多種類型的癌癥中開展調(diào)查，研究PSPC1參與癌癥發(fā)展的機制[26]。他們發(fā)現(xiàn)，PSPC1在多種癌癥中出現(xiàn)上調(diào)，包括晚期的肺癌，乳腺癌和肝癌，并且導(dǎo)致臨床結(jié)局不良。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PSPC1能夠增加癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，可與磷酸化狀態(tài)的Smad2/3分子相互作用，調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)Smad2/3信號通路，增加癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)分泌。此外，研究還顯示PSPC1能夠改變Smad2/3蛋白對不同基因的結(jié)合優(yōu)先度，調(diào)控促癌和抑癌基因的表達(dá)，并在其中發(fā)揮主導(dǎo)性作用。這些研究結(jié)果提示癌細(xì)胞中存在PSPC1-Smad2/3-TGF-β1作用軸，PSPC1可能作為抗癌治療的一個新靶點。

4.2.4 神經(jīng)退行性疾病Yu等人以3xTg-AD小鼠為研究對象，在飲水中添加低劑量銅干預(yù)，并對其行為和腦部海馬線粒體和核蛋白進(jìn)行分析。結(jié)果表明，小鼠大腦海馬部位氧化應(yīng)激和DNA損傷水平顯著增加，突觸相關(guān)蛋白表達(dá)降低，同時PSPC1表達(dá)出現(xiàn)顯著下降，提示其可能參與重金屬誘導(dǎo)AD的發(fā)病過程[27]。Shi等人同樣研究發(fā)現(xiàn)，在攜帶有3種人類變異基因，可產(chǎn)生β淀粉樣變的Tg小鼠中(3xTg-AD小鼠)，其大部分皮質(zhì)神經(jīng)元中均缺乏PSPC1，而在普通的Tg小鼠和對照小鼠的皮質(zhì)中則沒有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。Western blot的結(jié)果也顯示，在3xTg-AD小鼠海馬部位的細(xì)胞核內(nèi)，PSPC1的表也出現(xiàn)顯著下降。這些結(jié)果表明，PSPC1可能在AD發(fā)病過程淀粉樣變所致神經(jīng)元損傷中發(fā)揮一定作用[28]。

4.2.5 調(diào)控脂肪細(xì)胞功能Wang等研究發(fā)現(xiàn)，PSPC1可能參與調(diào)控脂肪細(xì)胞的形成和功能調(diào)控。在體外研究中，PSPC1結(jié)合到許多脂肪細(xì)胞RNA 3'非編碼區(qū)，包括RNA編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子-早期B細(xì)胞因子1(early B cell factor 1，EBF1)。從脂肪細(xì)胞中純化旁斑結(jié)構(gòu)復(fù)合體后發(fā)現(xiàn)，PSPC1與RNA轉(zhuǎn)運因子-DEAD盒RNA解旋酶3(DEAD-box RNA helicase 3，DDX3X)存在密切聯(lián)系，并呈現(xiàn)分化依賴的模式。尤其需要注意的是，PSPC1在分化過程中從細(xì)胞核中逸出到細(xì)胞質(zhì)的過程中伴隨著脂肪形成相關(guān)RNA轉(zhuǎn)運增加。缺乏PSPC1的小鼠脂肪中出現(xiàn)脂質(zhì)儲存和脂肪組織總量下降，并因為補償性的能量消耗增加而對膳食誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗具有耐受能力。這些發(fā)現(xiàn)表明PSPC1依賴的RNA成熟在脂肪生成和功能的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮一定的作用[29]。

4.2.6 保護(hù)生殖細(xì)胞此外，在鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯誘導(dǎo)的睪丸支持細(xì)胞損傷過程中發(fā)現(xiàn)，PSPC1和NONO均出現(xiàn)了上調(diào)；在抑制NONO和PSPC1表達(dá)時，細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激水平增強，凋亡增加[30]。進(jìn)一步探討其機制發(fā)現(xiàn)，PSPC1和NONO能夠協(xié)同結(jié)合到乙醛脫氫酶1 DNA促進(jìn)子CCGGAGTC區(qū)域，轉(zhuǎn)錄激活乙醛脫氫酶1，從而延緩鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯所引起的細(xì)胞損傷。

5 小結(jié)

近年來的研究表明，PSPC1不僅僅是旁斑蛋白的結(jié)構(gòu)性組分，同時可能是具有核心功能作用的生物大分子。然而，其發(fā)揮作用的機制及其在細(xì)胞整體的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)中的地位還有待明確。例如，其在多種疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，是通過多種不同的機制還是以同一種作用機制的不同表現(xiàn)形式發(fā)揮效應(yīng)，還不得而知。深入研究PSPC1的生物學(xué)功能及其作用機制，將有助于進(jìn)一步理解細(xì)胞生物學(xué)過程，為疾病防治提供有益的信息。