王全凱，謝廣云，馬順鵬 ，郭浩然，烏瀚寶櫟爾，宋佳陽，許建寧，*

(1.中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，北京 100050；2.江陰市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 無錫 214434；3.中國疾病預(yù)防控制中心化學(xué)污染與健康安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(glycidyl methacrylate，GMA)，又稱甲基丙烯酸縮水甘油酯，作為聚合反應(yīng)單體的一種，在食品包裝材料的內(nèi)表面涂層有廣泛應(yīng)用；同時，還是牙科治療材料中樹脂和粘合劑的重要組分[1-2]。研究表明，GMA屬于低毒類化學(xué)物質(zhì)，具有明顯的刺激性，可引發(fā)豚鼠皮膚的速發(fā)型和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，多項(xiàng)致突變試驗(yàn)結(jié)果陽性，長期暴露存在生殖發(fā)育毒性，也具有潛在致癌性[3]。目前，對其遺傳毒性的系統(tǒng)評價(jià)仍缺少足夠的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)，毒性機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

體外哺乳動物細(xì)胞微核試驗(yàn)是評價(jià)化學(xué)物質(zhì)遺傳毒性的主要手段。在不同劑量受試物暴露的條件下，通過觀察分裂間期細(xì)胞的微核形成數(shù)量，來反映細(xì)胞染色體斷裂和非整倍體作用的活性改變，基于此評價(jià)受試物的遺傳毒性[4-5]。本研究以中國倉鼠肺細(xì)胞(V79)為對象，對不同劑量GMA誘發(fā)其細(xì)胞的微核發(fā)生率進(jìn)行評價(jià)，為進(jìn)一步研究GMA的毒性作用機(jī)制提供證據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器與試劑

甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯，購于美國Sigma公司，CAS號106-91-2，分子式C7H10O3，熔點(diǎn)＜-50℃，沸點(diǎn)189℃，密度1.042 g/mL(25℃)。MEM培養(yǎng)基購于美國Life Technologies公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購于美國Gibco公司；細(xì)胞松弛素B、Giemsa染料、絲裂霉素C和環(huán)磷酰胺均購于美國Sigma公司；雙抗(青鏈霉素混合液)購于北京Solarbio公司。

CO2培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司；超凈工作臺購于北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；臺式高速離心機(jī)購于BECKMAN公司；倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；生物顯微鏡購于日本Nikon公司。中國倉鼠肺細(xì)胞(V79)，購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)液氮凍存的V79細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含10%FBS的MEM培養(yǎng)液，置37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿85%瓶底面積左右，加入0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3進(jìn)行傳代，接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。期間觀察、記錄各瓶細(xì)胞生長及形態(tài)變化。取對數(shù)生長期的V79細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)本課題組通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定GMA對V79細(xì)胞的絕對致死濃度(LC100)70 μg/mL，因此選擇終濃度 20、30、40、50、60 和 70 μg/mL 的GMA進(jìn)行染毒處理，每個濃度組設(shè)3個平行樣，同時設(shè)DMSO溶劑對照；置培養(yǎng)箱中24 h后，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)過臺盼藍(lán)染色后，使用計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)量，每個濃度組重復(fù)計(jì)數(shù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率/%=同一濃度組活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%

相對存活率/%=同一濃度組的平均活細(xì)胞數(shù)/DMSO溶劑對照組平均存活細(xì)胞數(shù)×100%

1.2.3 V79細(xì)胞的體外微核實(shí)驗(yàn)及評價(jià)使用濃度分別為2.25、4.5、9.0、18.0、36.0 μg/mL的GMA染毒V79細(xì)胞，設(shè)置空白對照組、DMSO對照組和陽性對照組。3 h處理組分別在加和不加體外活化系統(tǒng)(S9)條件下開展微核試驗(yàn)評價(jià)，24 h處理組只在不加S9條件下進(jìn)行。無S9條件下，0.5 μg/mL的絲裂霉素C作為陽性對照；有S9條件下，5 μg/mL的環(huán)磷酰胺為陽性對照。GMA染毒V79細(xì)胞3 h后，更換新的MEM培養(yǎng)液和終濃度為5 μg/mL的細(xì)胞松弛素B(cyto B)，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h收獲細(xì)胞。GMA接觸V79細(xì)胞24 h處理組，染毒結(jié)束后收獲細(xì)胞。

體外微核試驗(yàn)采用經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)發(fā)布的《體外哺乳動物細(xì)胞微核試驗(yàn)方法及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》(No.487)[6]。細(xì)胞培養(yǎng)至24 h后收獲細(xì)胞，加入0.075 mol/L KCI溶液5 mL，使用固定液(V甲醇∶V冰醋酸=4∶1)反復(fù)固定，最后使用Giemsa染液進(jìn)行染色。在光學(xué)顯微鏡下(×40)觀察，要求每個劑量組觀察不少于2 000個雙核細(xì)胞，并記錄含有微核的雙核細(xì)胞數(shù)，計(jì)算微核細(xì)胞率；此外，至少觀察500個細(xì)胞，通過計(jì)算復(fù)制指數(shù)，評價(jià)V79細(xì)胞的增殖情況。

微核細(xì)胞率/‰=觀察到含微核的細(xì)胞數(shù)/觀察的總雙核細(xì)胞數(shù)×1 000‰

復(fù)制指數(shù)/%=雙核細(xì)胞數(shù)/(雙核細(xì)胞數(shù)+單核細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，細(xì)胞復(fù)制指數(shù)和雙核細(xì)胞微核率的比較采用卡方檢驗(yàn)，線性回歸模型用來分析濃度和效應(yīng)的相關(guān)性。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 GMA對V79細(xì)胞的毒性作用

細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果如表1所示，隨著染毒劑量的增加，V79細(xì)胞的存活率降低，呈濃度-效應(yīng)關(guān)系(R2=0.892，P＜0.01)。經(jīng)計(jì)算，GMA半數(shù)致死濃度(LC50)為35.2 μg/mL。根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用2.25～36.0 μg/mL劑量范圍作為V79細(xì)胞微核試驗(yàn)的染毒劑量。

表1 GMA對V79細(xì)胞的毒性作用

2.2 GMA對V79細(xì)胞復(fù)制指數(shù)的影響

GMA染毒的不同劑量組的細(xì)胞復(fù)制指數(shù)結(jié)果見表2，在加與不加S9條件下，各染毒劑量組復(fù)制指數(shù)的變化均在正常范圍之內(nèi)，未見GMA對V79細(xì)胞復(fù)制指數(shù)產(chǎn)生明顯影響。

2.3 GMA對V79細(xì)胞微核率的影響

圖1為V79細(xì)胞染色固定后的顯微鏡下圖，GMA染毒劑量在2.25～36.0 μg/mL范圍內(nèi)，V79細(xì)胞微核率的結(jié)果見表3。在無S9條件下，與DMSO溶劑對照組相比，隨著GMA染毒濃度的增加，3和24 h組的V79細(xì)胞微核率均逐漸升高，呈明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系(3 h 染 毒 組R2=0.967，P＜0.01；24 h 染 毒 組R2=0.959，P＜0.01)，其中在 9.0、18.0、36.0 μg/mL 濃度組的微核細(xì)胞率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。有S9條件下，與對照組相比，各劑量組GMA接觸3 h的微核細(xì)胞率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 GMA染毒V79細(xì)胞復(fù)制指數(shù)結(jié)果

圖1 顯微鏡下觀察V79細(xì)胞染色固定后的雙核細(xì)胞(×40)

3 討論

甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯作為雙官能團(tuán)單體的一種，具有環(huán)氧基團(tuán)的親電性、雙鍵烷化的特性，提示GMA可能會對細(xì)胞造成氧化性損傷或直接作用于DNA，造成染色體損傷[7]。雖然美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)將其列為可與食品接觸的材料，但目前對于人群每日的潛在接觸和攝入程度尚不清楚。隨著GMA在食品包裝材料及醫(yī)療材料領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，GMA的職業(yè)暴露和消費(fèi)者接觸攝入對人類健康的影響越來越引發(fā)人們的關(guān)注[2]。

受試物的非整倍體劑和斷裂劑效應(yīng)是誘發(fā)染色體潛在損傷的基礎(chǔ)，而體外哺乳動物細(xì)胞微核試驗(yàn)?zāi)軌蛲瑫r檢測到這兩種誘發(fā)效應(yīng)。當(dāng)微核來源于滯后的整條染色體時，運(yùn)用本方法的檢測分析比傳統(tǒng)的染色體畸變試驗(yàn)更為有效[9]，OECD將其作為非整倍體劑和染色體斷裂劑誘發(fā)效應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)替代方法。越來越多的研究表明，無論是在用或不用細(xì)胞松弛素B處理的情況下，在CHO、V79、CHL/IU和L5178Y等嚙齒類細(xì)胞株以及人淋巴細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)都是非常有效的[10-11]。在國際遺傳毒性技術(shù)科學(xué)委員會開展的合作研究和國際遺傳毒性試驗(yàn)工作組的報(bào)告框架中，體外哺乳動物細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果也是必不可少的內(nèi)容。

在本研究中，選擇2.25～36.0 μg/mL的GMA染毒劑量范圍處理V79細(xì)胞，對GMA誘發(fā)V79細(xì)胞的遺傳毒性進(jìn)行評價(jià)。在加或不加S9條件下，各染毒劑量組均未見GMA對V79細(xì)胞復(fù)制指數(shù)產(chǎn)生明顯影響，這表明在此濃度范圍內(nèi)，GMA對V79細(xì)胞的增殖無影響。在無S9條件下，與對照組相比，染毒3和24 h處理組的V79細(xì)胞的微核率均逐漸升高，并呈明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系，其中高濃度組V79細(xì)胞的微核率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示GMA可以誘發(fā)V79細(xì)胞的染色體或紡錘體損傷，這與課題組早期的GMA致突變研究有良好的相關(guān)性[12]。在加S9條件下，染毒3 h的高劑量組微核細(xì)胞率與對照組相比，兩者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于缺乏體內(nèi)代謝活化系統(tǒng)是影響體外微核試驗(yàn)結(jié)果的因素之一，只有經(jīng)代謝活化后，化學(xué)物質(zhì)的毒性檢測才盡可能接近人體真實(shí)接觸的毒作用情況[6]。而在體內(nèi)微核試驗(yàn)的研究中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)口染毒只有在高劑量組骨髓細(xì)胞微核率升高，在腹腔注射染毒的微核試驗(yàn)研究中，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞微核數(shù)量存在劑量-反應(yīng)關(guān)系[13]。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)室條件下，GMA濃度在2.25～36.0 μg/mL范圍內(nèi)，可致V79細(xì)胞的微核率升高，表明GMA可誘發(fā)遺傳物質(zhì)損傷，具有遺傳毒性。