謝廣云，郭浩然，王全凱 ，馬順鵬，宋佳陽，烏瀚寶櫟爾，許建寧，*

(1.中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，北京 100050；2.江陰市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 無錫 214434；3.中國疾病預(yù)防控制中心化學(xué)污染與健康安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)LINC00472位于人類染色體6q13基因間區(qū)，又叫做P53相關(guān)LncRNA(P53 related LncRNA，P53RRA)。研究發(fā)現(xiàn)，LINC00472的表達(dá)水平與乳腺癌、上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中LINC00472高表達(dá)乳腺癌患者的治療效果和生存時(shí)間都要優(yōu)于低表達(dá)的患者[1-2]。而LINC00472在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的表達(dá)變化情況及作用機(jī)制未見報(bào)道。

甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(glycidyl methacrylate，GMA)，又稱甲基丙烯酸縮水甘油酯，主要用于高分子材料(樹脂、涂料、膠黏劑、活性稀釋劑等)的加工與合成，具有良好的防紫外線、耐水和耐熱等特性[3-4]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，GMA具有致癌危險(xiǎn)性，可誘發(fā)BALB/C 3T3細(xì)胞、SHE細(xì)胞、KMB-13細(xì)胞、16HBE細(xì)胞等不同類型的細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[5]。

本研究采用LncRNA芯片分析技術(shù)，篩選出在GMA誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的前、中、后期差異表達(dá)的LncRNA——LINC00472，通過生物信息學(xué)手段尋找其可能作用的靶基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)驗(yàn)證LINC00472及其靶基因的表達(dá)水平，探討其在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程的表達(dá)特點(diǎn)及意義。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

甲基丙烯酸縮水甘油酯(純度≥98.5%)，購于美國陶氏化學(xué)公司；二甲基亞砜(DMSO)，購于Sigma公司；胰蛋白酶、EDTANa2，均購于美國Amresco公司；MEM培養(yǎng)基粉，購于美國Hyclone公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)，購于天津?yàn)笊镏破饭荆磺噫溍顾鼗旌弦?100×)，購于北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑，購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，2X PCR master mix，購于美國Arraystar公司。

CO2培養(yǎng)箱，購于美國Thermo公司；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)，購于Heraeussepatech公司；紫外可見分光光度計(jì)(UV-2800H)，購于美國UNICO公司；7900HT Fast Real-Time PCR儀，購于美國Biosystems公司；凝膠成像系統(tǒng)，購于上海天能科技有限公司；ND-1000分光光度計(jì)，購于美國NanoDrop公司；ViiA 7實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系，購于美國Applied Biosystems公司；Arraystar Human LncRNA Microarray V4.0芯片技術(shù)服務(wù)和引物設(shè)計(jì)的技術(shù)支持由上?？党缮锕咎峁?。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化

人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)為SV40 largeT抗原永生化的人支氣管上皮細(xì)胞系，由美國加利福尼亞大學(xué)傳出。使用含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、青鏈霉素混合液(100倍稀釋)的MEM培養(yǎng)液，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，每瓶接種約5×105個(gè)，培養(yǎng)24 h后使用8 μg/mL的GMA進(jìn)行染毒處理(DMSO作為溶劑對(duì)照)。每次染毒時(shí)間為72 h，間隔24 h后進(jìn)行再次染毒，共處理3次，此時(shí)記為第1代，繼續(xù)傳代培養(yǎng)至第30代，觀察并記錄細(xì)胞的生長及形態(tài)學(xué)變化。采用刀豆蛋白A(ConA)凝集實(shí)驗(yàn)和錨著依賴性(軟瓊脂)實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞轉(zhuǎn)化的前、中、后期鑒定細(xì)胞生物學(xué)特征。

1.3 LncRNA芯片分析

分別收集培養(yǎng)至第10、20、30代的GMA染毒組和DMSO對(duì)照組細(xì)胞，采用TRIzol提取總RNA，并使用RNase-Free DNase I和RNAclean Kit離心柱型純化試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化，去除可能存在的DNA污染。通過ND-1000分光光度計(jì)測得的不同波長下的吸光度值評(píng)估總RNA的純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。使用Agilent Quick Amp Labeling Kit標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA，在Agilent SureHyb雜交儀中將其與LncRNA芯片進(jìn)行雜交，并使用NanoDrop檢測熒光標(biāo)記效率，以保證后續(xù)芯片結(jié)果的可靠性。

通過Arraystar RNA Flash Labeling Kit對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記后，使用Agilent SureHyb進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，芯片洗滌后，Agilent DNA Microarray Scanner掃描信號(hào)值。經(jīng)過芯片標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到LncRNA的表達(dá)變化情況。以LncRNA相對(duì)表達(dá)量的差異倍數(shù)＞2為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選第10、20、30代均出現(xiàn)差異變化的基因，通過做qPCR驗(yàn)證其在細(xì)胞中的表達(dá)情況，并查閱文獻(xiàn)及DIANA TOOL、NCBI BLAST等生物信息學(xué)分析手段預(yù)測LINC00472作用的靶基因和可能存在的生物學(xué)功能。

1.4 qPCR檢測LINC00472和miR-24-3P的表達(dá)水平

用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取純化后的總RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括：上下游引物各0.5 μL、2×Master Mix 5 μL、cDNA模板2 μL及RNase-free水2 μL；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火60 s，95℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。分別以管家基因β-actin和U6為內(nèi)參，以同代溶劑對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)水平的均值為基準(zhǔn)，采用2-ΔΔCT計(jì)算的相對(duì)表達(dá)水平。管家基因及目的基因的引物序列見表1。

表1 qPCR基因引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GMA染毒組和DMSO對(duì)照組間的基因表達(dá)水平的差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較選用SNK檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 LINC00472在16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)情況的芯片分析結(jié)果

隨著GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的完成，與同期對(duì)照組相比，GMA組ConA凝集的速度明顯加快，并在第30代軟瓊脂試驗(yàn)中形成集落。按照設(shè)定的篩選標(biāo)準(zhǔn)，共有72個(gè)差異LncRNA符合要求，其中LINC00472在GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化各個(gè)時(shí)期表達(dá)情況的芯片分析結(jié)果見圖1。與同代DMSO對(duì)照組相比，LINC00472表達(dá)水平在細(xì)胞轉(zhuǎn)化的前期、中期和后期分別下調(diào)2.30倍、下調(diào)3.57倍和上調(diào)2.32倍。在16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，3個(gè)時(shí)期DMSO對(duì)照組中LINC00472的相對(duì)表達(dá)水平(校正信號(hào)值)逐漸下調(diào)，而GMA染毒組前期和中期先逐漸下調(diào)，而在后期表現(xiàn)為上調(diào)。

圖1 GMA處理組和DMSO對(duì)照組16HBE細(xì)胞LINC00472的變化情況

2.2 LINC00472在16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)情況的qPCR檢測結(jié)果

qPCR驗(yàn)證的結(jié)果顯示，與同代齡DMSO對(duì)照組相比，第10、20和30代GMA染毒組細(xì)胞的LINC00472相對(duì)表達(dá)水平分別為1.07±0.07、0.364±0.04、2.34±0.44(圖2)。其中第20、30代染毒組的相對(duì)表達(dá)水平變化方向與芯片結(jié)果一致，且與對(duì)照組相比，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。此外，3個(gè)時(shí)期的GMA染毒組之間LINC00472的相對(duì)表達(dá)水平也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

圖2 LINC00472的qPCR驗(yàn)證結(jié)果

2.3 LINC00472在16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的靶基因預(yù)測及靶基因的qPCR驗(yàn)證結(jié)果

為進(jìn)一步研究LINC00472的生物學(xué)功能，通過查閱有關(guān)文獻(xiàn)及生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫信息[6]，得到miR-24-3p很可能是LINC00472的一個(gè)作用靶基因，LINC00472和miR-24-3p的結(jié)合位點(diǎn)見圖3。miR-24-3p的qPCR檢測結(jié)果顯示，與同代齡DMSO對(duì)照組相比，GMA染毒組細(xì)胞的miR-24-3p在第10、20、30代時(shí)的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.35±0.03、0.82±0.05、1.43±0.16，兩組的相對(duì)表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其差異倍數(shù)均未超過2倍。

圖3 LINC00472和miR-24-3p的結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

LncRNA是一類長度超過200個(gè)核苷酸的不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子。起初lncRNAs被認(rèn)為在人類生理過程中不發(fā)揮作用。但近年來研究表明，LncRNA雖然不直接參與基因編碼和蛋白質(zhì)合成，但在染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄干擾發(fā)揮著非常重要的功能[7]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA與人類癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]，但在化學(xué)物質(zhì)的誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究中鮮有報(bào)道。

Luo等[9]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MALAT1在PM2.5誘導(dǎo)人支氣管上皮HBE和BEAS-2B細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化中高表達(dá)，隨著細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的完成，其相對(duì)表達(dá)水平的改變呈上升趨勢(shì)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1通過與miR-204相互作用，在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮“致癌基因”作用。在本研究中，我們通過對(duì)GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的第10、20和30代的高通量芯片結(jié)果進(jìn)行篩選分析，發(fā)現(xiàn)LINC00472的表達(dá)水平由轉(zhuǎn)化初期的逐步下調(diào)到轉(zhuǎn)化后期的上調(diào)，這一動(dòng)態(tài)改變提示LINC00472可能在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮作用。

LINC00472作為16號(hào)染色體基因間區(qū)發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA，Zou等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，LINC00472與非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌患者中低表達(dá)，其中在非小細(xì)胞肺癌中通過激活P53信號(hào)通路，進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，表明LINC00472在肺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。此外，LINC00472被發(fā)現(xiàn)在人類結(jié)腸直腸癌中也發(fā)揮重要作用[12]。本研究通過LncRNA芯片和qPCR技術(shù)檢測了LINC00472在GMA誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程的表達(dá)改變。結(jié)果表明，第10代對(duì)照組和GMA染毒組相對(duì)表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第20、30代的驗(yàn)證結(jié)果與芯片分析結(jié)果一致，相對(duì)表達(dá)水平呈現(xiàn)由低到高的變化趨勢(shì)。我們推測LINC00472在GMA誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化早期其作用被抑制，隨著轉(zhuǎn)化的完成開始發(fā)揮抑癌基因的作用。

越來越多的研究表明，微RNA(microRNA，miRNA)可以直接調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而影響人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。而LncRNA可以作為miRNA的內(nèi)源性競爭RNA和海綿體，間接參與調(diào)控miRNA的下游靶基因[13]。Chen等[14]在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，肝癌和正常組織的LncRNA表達(dá)水平存在差異，LINC00472在癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，且表達(dá)水平低的患者預(yù)后水平較差，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LINC00472的表達(dá)水平與miR-93-5P呈負(fù)相關(guān)，miR-93-5P能夠特異結(jié)合LINC00472，靶向調(diào)節(jié)LINC00472使其表達(dá)減少，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。本研究中通過查閱有關(guān)文獻(xiàn)和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)LINC00472和miR-24-3p之間存在堿基結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)測在GMA誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，miR-24-3p可能與LINC00472共同發(fā)揮作用。然而miR-24-3p的qPCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，與同期DMSO對(duì)照組相比，第10、20和30代GMA染毒組細(xì)胞相對(duì)表達(dá)水平的差異倍數(shù)均未超過2倍，變化趨勢(shì)與LINC00472一致，而miRNA普遍作為內(nèi)源性競爭RNA分子結(jié)合LncRNA共同發(fā)揮作用[15]。因此，LINC00472和miR-24-3p在此過程中是否存在相互作用以及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，在GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，芯片分析和實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果表明，LINC00472在轉(zhuǎn)化中期低表達(dá)，轉(zhuǎn)化后期高表達(dá)，推測LINC00472可能在GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后期發(fā)揮作用，但是否通過結(jié)合miR-24-3p參與調(diào)控這一過程，還有待進(jìn)一步研究。