李明慧 尚一娜 霍麒文 陳 境 張曉寧 邢葉妮 楊姝玉 王俊國

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 呼和浩特010018）

高密度發(fā)酵技術(shù)（High Cell Density Culture）是指微生物在液體培養(yǎng)基中菌體發(fā)酵密度較普通培養(yǎng)方法顯著提高，且超過常規(guī)培養(yǎng)10 倍以上的培養(yǎng)技術(shù)[1]。優(yōu)化菌體的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件是目前常用的技術(shù)方法[2]。相比于培養(yǎng)基成分的改變，培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法更加簡單，生產(chǎn)成本更加低廉，更有利于實施工業(yè)化。

真空冷凍干燥技術(shù)（Vacuum Freeze -Drying Technology）是將細胞懸浮液凍結(jié)后，在真空低溫環(huán)境下使冰晶升華，物料脫水變成凍干菌粉的一種干燥技術(shù)[3]。冷凍干燥技術(shù)能長時間地保持菌株的活力，便于發(fā)酵劑的貯存和工業(yè)化應用[4]。在凍干過程中會給菌體帶來傷害，導致菌種活力下降，甚至失水死亡。許多研究證實通過添加保護劑或改善冷凍干燥的工藝條件均能提高菌株的凍干存活率[5]。最新研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件也可以提高菌體抗冷凍干燥的性能。

綜上所述，通過改變培養(yǎng)條件不但能夠增加高密度發(fā)酵的活菌數(shù)，而且有可能對菌株的冷凍干燥抗性產(chǎn)生影響。目前研究培養(yǎng)條件對乳酸菌生長影響的課題很多，而兼顧提高高密度發(fā)酵后的活菌數(shù)的同時，增強菌株冷凍干燥抗性的研究卻很少。

本試驗中以益生菌植物乳桿菌 （L.plantarum）LIP-1 為研究對象，該菌株具有良好的降血脂功效[6]。以實驗室前期經(jīng)培養(yǎng)基成分優(yōu)化的MRS 培養(yǎng)基為基礎，用高密度發(fā)酵的活菌數(shù)及冷凍干燥菌株的存活率為對象，探討改變培養(yǎng)條件是否可增加菌種的冷凍干燥抗性及其穩(wěn)定性，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品在市場上的競爭力。

1 材料與方法

1.1 菌種

采用植物乳桿菌LIP-1，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學的乳品生物技術(shù)與工程教育部重點試驗室提供。

1.2 基礎培養(yǎng)基

冷凍保護劑，MRS優(yōu)化培養(yǎng)基[7]、MRS培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基。

1.3 儀器、設備

ZHJH-1214B 凈化工作臺，南京依貝儀器設備有限公司；立式高壓蒸汽滅菌鍋，日本三洋MLS-3750；高速離心機，德國eppendorf 公司；恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272 型），上海；全自動干熱滅菌器（ADVANTEC SP-650 型），日本；真空冷凍干燥機，Labconco FreeZone。

2 方法

2.1 試驗設計

應用單因素試驗研究不同培養(yǎng)條件（溫度、培養(yǎng)基初始pH 及其接種量） 對菌株高密度發(fā)酵活菌數(shù)和凍干存活率的影響。以此為結(jié)果，運用響應面分析法對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，得出最佳培養(yǎng)條件。

2.2 菌株的活化

本試驗的接種量為2%（體積分數(shù)，下同），37℃，培養(yǎng)18 h。活化菌株采用脫脂乳培養(yǎng)基，再傳代MRS 培養(yǎng)基中，采用3 代菌株做試驗。

2.3 最適培養(yǎng)溫度的確定

以優(yōu)化的MRS 培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，以25，30，34，37，42 ℃5 個溫度為改變因素，按2%接種量接種發(fā)酵18 h，4 000 r/min 離心10 min，收集菌體，用無菌生理鹽水按上述方法洗滌兩次，添加滅菌的冷凍保護劑2 mL，振蕩混勻，取1 mL 計算活菌數(shù)。另取1 mL 置離心管中-70 ℃預凍，冷凍干燥18 h 后復水1 mL，計算冷凍干燥存活率，確定最適培養(yǎng)溫度。

2.4 最適培養(yǎng)基初始培養(yǎng)pH 的確定

將前優(yōu)化培養(yǎng)基的pH 值分別調(diào)至5.0，5.6，6.2，6.8，7.4，按2%接種量接種，在最適培養(yǎng)溫度下發(fā)酵18 h 后測定發(fā)酵終點pH，計算活菌數(shù)和凍干存活率，具體方法同上，確定最適培養(yǎng)基初始培養(yǎng)pH。

2.5 最適接種量的確定

以前面試驗確定的最適培養(yǎng)溫度和初始培養(yǎng)pH 為條件，將接種量分別設定為2%，4%，6%，8%，10%，發(fā)酵18 h 后，計算活菌數(shù)和凍干存活率，具體方法同上，確定最適接種量。

2.6 響應面法優(yōu)化高密度發(fā)酵存活率和抗冷凍性能的培養(yǎng)條件。

采用響應面優(yōu)化法，根據(jù) Box-Behnken 原理，以發(fā)酵培養(yǎng)基的初始培養(yǎng)pH 值、培養(yǎng)溫度、接種量3 個因素為自變量，以高密度發(fā)酵后的菌落數(shù)及凍干存活率為響應值，篩選出最優(yōu)培養(yǎng)條件。根據(jù)響應面分析法得出的最佳生長條件，驗證試驗。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

應用SPSS 22.0 系統(tǒng)的統(tǒng)計軟件對各組試驗結(jié)果進行方差分析及顯著性檢驗。以Box－Behnken 進程對響應面設計進行二次響應面分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 培養(yǎng)溫度對冷凍干燥存活率的作用效果

培養(yǎng)溫度是影響菌株發(fā)酵活力的一項重要因素。從圖1可以看出，當培養(yǎng)溫度為30 ℃時，高密度發(fā)酵菌數(shù)最高，達9.9456 lg（CFU/mL），其后隨著溫度的升高呈下降趨勢，37 ℃時菌數(shù)為9.8823 lg（CFU/mL），減少1%，差異顯著（P<0.05）。培養(yǎng)溫度的改變對菌體的抗冷凍干燥性能的影響差異顯著，37 ℃時LIP-1 的冷凍干燥存活率最高，為81.61%，較30 ℃高8.80%，差異顯著（P<0.05）。綜合考量兩個因素，選擇37 ℃做下一步試驗。

周金雨等[8]對植物乳桿菌KLDS 1.0391 的研究證實了植物乳桿菌在34 ℃環(huán)境下高密度發(fā)酵效果更好。白永強等[9]對植物乳桿菌Zhang-LL 高密度發(fā)酵的研究也證實高密度發(fā)酵植物乳桿菌的最適溫度為34 ℃。而植物乳桿菌LIP-1 在30 ℃時高密度發(fā)酵活菌數(shù)最高，這可能與其特性有關(guān)，該菌株分離自新疆地區(qū)的酸馬奶中，所屬環(huán)境溫度較低，最適培養(yǎng)溫度與其它植物乳桿菌相比較低。

Li 等[10]對保加利亞乳桿菌L2 的研究表明，在較低溫度下培養(yǎng)乳酸菌，可以提高菌株冷凍干燥存活率，這是由于在低溫條件下，細胞膜中乳酸脫氫酶數(shù)量增多，使細胞膜中不飽和脂肪酸含量增加，細胞膜的流動性得到改善，減少了細胞膜的損傷[11]，從而提高菌體的抗冷凍性[12]。大量研究表明在較低的溫度下培養(yǎng)細菌，使細胞膜中乳酸脫氫酶增加[11]，導致不飽和脂肪酸含量增加，提高細胞膜的流動性，從而提高菌體的抗冷凍性[13]。Liu 等[14]將羅伊氏乳桿菌I5007 的培養(yǎng)溫度從37 ℃提至42 ℃，6 h 后與37 ℃對比，其冷凍的存活率提至17.87%，細胞膜中UFA/SFA 的比值明顯提高。植物乳桿菌LIP-1 最適宜的發(fā)酵溫度為30 ℃，37 ℃培養(yǎng)的凍干存活率顯著高于25 ℃的，這可能與菌株的特異性有關(guān)。

3.2 不同培養(yǎng)pH 值對冷凍干燥存活率的作用效果

由圖2可知，37 ℃培養(yǎng)時活菌數(shù)因初始培養(yǎng)pH 值的升高，高密度發(fā)酵活菌數(shù)呈先增加后減少的趨勢，在初始pH 值6.8 時，活菌數(shù)達到最大，為9.924 lg（CFU/mL），隨后活菌數(shù)呈下降趨勢；冷凍干燥后的活菌數(shù)在初始培養(yǎng)pH 值為6.8時最高（82.39%），明顯多于其它4 組（P<0.05）。最終確定最適培養(yǎng)pH 值為6.8。

圖1 不同培養(yǎng)溫度對植物乳桿菌LIP-1 的影響Fig.1 Effect of different culture temperature on Lactobacillus plantarum LIP-1

圖2 不同初始培養(yǎng)pH 值對植物乳桿菌LIP-1 的影響Fig.2 Effect of different culture pH on Lactobacillus plantarum LIP-1

表1 初始培養(yǎng)pH 值和發(fā)酵終點pH 值Table 1 Initial culture pH and end point of fermentation pH

不同乳酸菌的生長最適pH 值是不同的，選擇適宜的pH 值對其高密度發(fā)酵能力起促進作用[15]。試驗結(jié)果表明：pH 6.8 時高密度發(fā)酵產(chǎn)生的活菌數(shù)最多。這可能是因為不適宜的pH 值抑制試驗菌株細胞內(nèi)酶的活性，以及細胞膜攜帶電荷的狀態(tài)[16]，改變細胞膜的通透性和流動性，影響菌體代謝和吸收，抑制菌體生長。

初始培養(yǎng)pH 6.8 較pH 5.0 時菌株冷凍干燥存活率最高，這與Liu 等[17]的試驗結(jié)果相似，羅伊氏乳桿菌I5007 在pH 5.7 與pH 6.7 的培養(yǎng)條件下，其冷凍存活率從12.95%提高到27.38%，這可能是由于pH 6.8 時菌株與酸的作用能力強，中和性能好，可以快速適應發(fā)酵環(huán)境。研究表明發(fā)酵過程中的pH 值變化會引起細胞膜中的脂肪酸這類成分變化[18]，改變其流動性，影響菌體抗性[12]。李華等[11，19]也認為發(fā)酵終點時，較低的培養(yǎng)基pH 更有助于C19cyc11 的合成，可以提高冷凍干燥存活率。在pH 6.8 時發(fā)酵終點pH 值為3.91，這是因為發(fā)酵結(jié)束時較低的pH 值更有利于合成不飽和脂肪酸，調(diào)節(jié)冷凍干燥過程中細胞膜的流動性，提高菌體抗冷凍活性。

3.3 接種量對冷凍干燥存活率的作用效果

如圖3可知，接菌量在2%，4%，6%，8%時，隨著接種量的增大，高密度發(fā)酵活菌數(shù)增加，在接種量為10%時，高密度發(fā)酵活菌數(shù)較8%有所降低。由此可以看出，在一定的范圍，接種濃度越高，菌體的活菌數(shù)對數(shù)值越大，然而當接種量過多時，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分不能供給菌體生長，菌體的繁殖受到限制，菌體產(chǎn)酸過快，在相對適應的環(huán)境下菌體生長受到酸性環(huán)境的抑制。因接種量為8%時活菌數(shù)最多達9.998lg（CFU/mL），故選擇8%接種量為宜（P<0.05）。

接種濃度過低，影響菌株生長的速度，而菌種濃度過高使其發(fā)酵和產(chǎn)酸的能力下降[20]。接種量的多少可以改變菌體的密度，菌體密度的多少可以改變發(fā)酵終點的時間。本試驗的培養(yǎng)時間都是18 h，造成菌體密度差異（P=0.05）。

從圖3可以看出，冷凍干燥后的存活率在81%左右，并未隨著接種量的改變有明顯差異（P＜0.05），說明接種量的多少雖然對發(fā)酵有影響，但是并不能改變凍干存活率，這可能是由于接種量的增加提高了植物乳桿菌LIP-1 的活菌數(shù)，而不能提高菌體的冷凍干燥抗性。

3.4 二次響應面分析對培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以單因素的試驗結(jié)果為基礎，通過Box-Behnken 對培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)pH 值和接種量3 個因素進行雙因素三水平分析，結(jié)果見表2。

圖3 接菌量增加對植物乳桿菌LIP-1 影響Fig.3 Effect of different inoculum size on Lactobacillus plantarum LIP-1

表2 響應面試驗設計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 高密度發(fā)酵后活菌數(shù)的回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation for the number of high cell density cultivation of Lactobacillus plantarum LIP-1

（續(xù)表3）

表4 冷凍干燥后凍干存活率的回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression equation for the survival rate of freeze-drying

通過Design Expert 軟件對表3數(shù)據(jù)進行分析，得到培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)pH 值和接種量及高密度發(fā)酵菌數(shù)、冷凍干燥存活率間的回歸方程，如（1）（2）所示。

對表3數(shù)據(jù)的分析表明，高密度發(fā)酵后活菌數(shù)模型P＜0.0001（極顯著），失擬項=0.1590（不顯著），模型確定系數(shù)R2=0.9931，校正系數(shù)R2adj=0.9842；對菌株抗冷凍干燥性的預測方差（表4）分析表明，模型P＜0.0001（極顯著），失擬項=0.4058（不顯著），模型確定系數(shù)R2=0.9837，校正系數(shù)R2adj=0.9627，以上結(jié)果均說明本預測模型和實際試驗設計的擬合度較高，可以用來預測菌體的生長情況和冷凍干燥后的存活率。對任兩個組數(shù)據(jù)對比來探討試驗菌株的生長情況，結(jié)果見響應曲面圖4；任兩組數(shù)據(jù)對比試驗菌株的冷凍干燥存活率見圖5。響應面圖的曲率反映各因素相互作用對試驗響應值的影響，若曲率呈圓形，則交互作用不顯著；若曲率是橢圓形，則交互作用顯著[21]。

圖4 培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)pH 值和接種量相互影響LIP-1 高密度發(fā)酵活菌數(shù)的響應效果圖Fig.4 Response surface plots showing the effects of culture temperature，culture pH and inoculation amount on the cell concentration of Lactobacillus plantarum LIP-1

圖4表明，當培養(yǎng)溫度一定時，高密度發(fā)酵活菌數(shù)隨著初始培養(yǎng)pH 值的增加不斷增加，達到一定的pH 值時，高密度發(fā)酵的活菌數(shù)緩慢降低；當初始培養(yǎng)pH 值一定時高密度發(fā)酵活菌數(shù)隨著培養(yǎng)溫度的升高逐漸增加，達到一定溫度時，活菌數(shù)緩慢降低，說明培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)的初始pH 值對活菌數(shù)的增長有一定的作用，曲率成圓形說明交互效果不顯著；溫度和接菌量的的曲率呈橢圓形，說明溫度和接菌量對活菌數(shù)的增加是有影響的，且交互效應較為顯著；培養(yǎng)pH 值和接種量對植物乳桿菌LIP-1 菌體的生長也有一定的影響，曲率呈圓形說明作用效果并不明顯。

由圖5可看出，當培養(yǎng)溫度一定時，冷凍干燥的存活率隨著接菌量的增加不斷增加，達到一定的接菌量時，冷凍干燥緩慢降低；當接菌量一定時冷凍干燥存活率隨著培養(yǎng)溫度的升高逐漸增加，達到一定溫度時，凍干存活率緩慢降低，培養(yǎng)溫度和接菌量值對菌體的繁殖也有一定的作用，曲率成橢圓形說明交互效果顯著。對3 組圖的分析發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度和pH 值以及接種量的改變對LIP-1菌體的凍干存活率均有較顯著的影響。

圖5 培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)pH 值和接種量相互影響LIP-1 冷凍干燥凍干存活率的響應效果圖Fig.5 Response surface plots showing the effects of culture temperature，culture pH and inoculation amount on the survival rate of freeze-drying of Lactobacillus plantarum LIP-1

從單因素和響應面結(jié)果得出，在30 ℃培養(yǎng)條件下，植物乳桿菌LIP-1 的發(fā)酵活性較好，然而相對于初始培養(yǎng)溫度37 ℃來說，其抗冷凍干燥的能力較差。經(jīng)響應面分析的培養(yǎng)溫度為36 ℃時菌體抗冷凍干燥性好，這可能是與37 ℃的培養(yǎng)溫度相比，低溫培養(yǎng)時可以促進環(huán)丙烷脂肪酸的合成，從而調(diào)節(jié)細胞膜的流動性，穩(wěn)定細胞膜的組成成分，并可調(diào)節(jié)胞內(nèi)酶的活性。

響應面優(yōu)化的pH 值為6.7 時菌體的高密度發(fā)酵活力及抗冷凍干燥活力最佳，這可能是菌株與酸的作用能力最強，中和性能較好，有利于菌體發(fā)酵。雖然不同的培養(yǎng)條件對植物乳桿菌LIP-1造成一定的影響，但不同的接菌量并不能改善高密度發(fā)酵和冷凍干燥損傷情況。

綜上，預測的最佳培養(yǎng)條件為：溫度35.91℃、pH 值6.7、接種量為8.83%。預測高密度發(fā)酵后LIP-1 的活菌數(shù)為10.175 lg（CFU/mL），經(jīng)過冷凍干燥的凍干存活率可達到83.48%。

以預測結(jié)果為條件，進行驗證試驗，將LIP-1以8.8%（體積分數(shù)）的接種量接種進行結(jié)果驗證，在pH 6.7、36 ℃的條件下發(fā)酵培養(yǎng)18 h。試驗測得高密度發(fā)酵菌數(shù)為10.1855 lg（CFU/mL），這與預測的結(jié)果相似率為99.89%；凍干存活率為83.40%，與預測值的相似率為99.90%。

4 結(jié)論

通過改變培養(yǎng)條件（溫度、接種量、初始培養(yǎng)pH）以提高植物乳桿菌LIP-1 高密度發(fā)酵活菌數(shù)以及抗冷凍干燥的存活率。在響應面優(yōu)化后獲得最佳培養(yǎng)條件參數(shù)：發(fā)酵溫度36 ℃、初始培養(yǎng)pH 6.7、接種量8.8%，在此條件下植物乳桿菌LIP-1活菌數(shù)為10.1855 lg（CFU/mL），冷凍干燥后的存活率達83.40%，較優(yōu)化培養(yǎng)條件前均有顯著提高（P<0.05）。該結(jié)果為通過改變培養(yǎng)條件提高菌株的高密度發(fā)酵活菌數(shù)以及凍干存活率提供了試驗依據(jù)。