王春　袁文峰　顧傳坤　王長?！●R強

摘 要 建立了檢測血液中11種喹諾酮類藥物殘留的超高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜方法。以正己醇、四氫呋喃和水形成的超分子溶劑為萃取溶劑，對血液樣品中的喹諾酮類藥物進行分散液液微萃取。采用單因素試驗和正交試驗考察了超分子溶劑組成、用量和渦旋時間等參數(shù)對萃取效率的影響。采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）色譜柱分離，以乙腈-0.15%（V/V）甲酸為流動相梯度洗脫，在電噴霧正離子模式下，利用多反應(yīng)監(jiān)測-信息關(guān)聯(lián)采集-增強子離子掃描復(fù)合模式進行定性定量分析。結(jié)果表明，11種喹諾酮類藥物在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R>0.998）， 檢出限為0.1～0.8 μg/L， 定量限為0.4～2.0 μg/L。在高中低3個加標(biāo)水平下，11種喹諾酮類藥物的回收率為70.8%～115.2%， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～11.5%（n=6）。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜;超分子溶劑;分散液液微萃取;喹諾酮類藥物

1 引 言

喹諾酮類藥物是一類具有抗菌作用的人工合成藥物，具有抗菌譜廣、抗菌力強、毒副作用小、價格低廉等特點，被廣泛用于治療各種感染性疾病。然而，該類藥物容易導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生，且具有潛在的致癌性和遺傳毒性，可能對人體健康造成潛在風(fēng)險[1， 2]。在畜牧和養(yǎng)殖領(lǐng)域，由于不合理用藥、不遵守休藥期等原因，導(dǎo)致藥物可能會超標(biāo)殘留于生物體內(nèi)。為確保動物源性食品質(zhì)量安全，開發(fā)喹諾酮類藥物殘留的檢測方法至關(guān)重要。目前，《中華人民共和國藥典》（2015年版）中針對喹諾酮類藥物的檢測方法主要為分光光度法和高效液相色譜法[3]，文獻報道的方法包括高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4～6]、毛細管電泳法[7，8]、酶聯(lián)免疫法[9，10]和膠體金法[11]等。其中，分光光度法、酶聯(lián)免疫法和膠體金法操作簡單，但選擇性較差，靈敏度較低;毛細管電泳法快速高效，但分離重現(xiàn)性較差。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法兼具靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢，是目前喹諾酮類藥物殘留檢測的常用方法。

三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜是一種混合型串聯(lián)質(zhì)譜儀，其設(shè)計是將傳統(tǒng)三重四極桿質(zhì)譜儀的最后一個四極桿改為線性離子阱，并可完成快速自由切換，即最后一個四極桿同時具備傳統(tǒng)四極桿和線性離子阱的功能，既保留了串聯(lián)四極桿的選擇性和靈敏度優(yōu)勢，也可實現(xiàn)線性離子阱增強二級碎片離子定性功能[12，13]，有利于提高復(fù)雜樣品基質(zhì)中痕量目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確定性能力。三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜已被廣泛應(yīng)用于生物樣品的分析檢測[14，15]。

樣品前處理方法很大程度上決定了分析方法的靈敏度和準(zhǔn)確性。由于血液樣品中含有大量的蛋白質(zhì)、磷脂和內(nèi)源性代謝物，因此有必要開發(fā)合適的樣品前處理方法，以消除樣品基質(zhì)干擾，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。超分子溶劑是指由兩親性化合物通過兩相或分子間有序自組裝過程形成的一種具有納米結(jié)構(gòu)的膠束聚集體[16]。超分子溶劑萃取是一種新型綠色萃取方法，成本低廉，操作簡便，可替代常規(guī)液液萃取中使用的有機溶劑 [17]，通常情況下多使用長鏈烷基醇或烷基酸與四氫呋喃和水混合，形成不溶于水的反向膠束。由于其出色的萃取性能，超分子溶劑也被廣泛應(yīng)用于樣品前處理過程[18]。

目前，將超分子溶劑萃取和三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用用于喹諾酮類藥物檢測的方法鮮有文獻報道。本研究采用超分子溶劑分散液液微萃取方法對血液中的喹諾酮類藥物進行萃取，將萃取與凈化同步完成，對影響萃取效果的烷基醇種類與用量、四氫呋喃用量和渦旋時間等主要條件進行了單因素試驗、正交試驗及統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)合三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜特有的多反應(yīng)監(jiān)測-信息關(guān)聯(lián)采集-增強子離子掃描復(fù)合模式，建立了血液中喹諾酮類藥物殘留的分析方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters公司）; QTRAP 6500+三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀、Analyst和MultiQuant數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國SCIEX公司）;? Milli-Q Integral 5型超純水儀（美國Merck Millipore公司）;? AB204-S型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）; CR 21N型高速冷凍離心機（日本Hitachi公司）; MS3型渦旋振蕩器（德國IKA公司）; KQ-600型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

甲醇、乙腈和四氫呋喃（色譜純， 美國Fisher公司）; 正戊醇、正己醇、正辛醇、正癸醇、正十一醇和正十二醇（百靈威科技有限公司）; 正庚醇和正壬醇（日本TCI公司）。11種喹諾酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：萘啶酸（99.5%）、惡喹酸（98.0%）、鹽酸環(huán)丙沙星（95.0%）、達氟沙星（97.5%）、恩諾沙星（98.0%）、那氟沙星（99.0%）、司帕沙星（99.0%）、鹽酸雙氟沙星（97.5%）和鹽酸莫西沙星（96.1%）購自德國Dr. Ehrenstorfer公司）; 培氟沙星（98.0%， 加拿大TRC公司）; 氧氟沙星（98.8%， 中國食品藥品檢定研究院）。11種喹諾酮類化合物的基本信息見表1。

2 實驗方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取11種喹諾酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10 mg（精確至0.1 mg），分別用表1中對應(yīng)的溶劑溶解并定容至10 mL，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。分別取11種喹諾酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，配制成濃度為20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4℃保存。使用時以甲醇逐級稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2.2 超分子溶劑的制備 移取2.5 mL正己醇和8 mL四氫呋喃，迅速注入50 mL離心管中，加入29.5 mL水， 以420 r/min磁力攪拌3 min， 3000 r/min離心10 min，用注射器移取上層有機相于適宜容器中，4℃密封保存。

2.2.3 樣品處理 采用活體取血法取血后立即移取0.1 mL血液樣品，置于預(yù)先加入0.2 mL超分子溶劑的2 mL聚丙烯離心管中，渦旋振蕩3 min，以5000 r/min離心10 min。移取上層液體50 μL于0.3 mL微量進樣瓶中，加入50 μL甲醇混勻，過0.22 μm微孔濾膜后，待超高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜測定。

2.2.4 分析條件 （1）色譜柱 ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）; 流速： 0.35 mL/min; 流動相： 0.15%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）。 （2）梯度洗脫程序 0～1.8 min， 10%～30% B; 1.8～2.2 min， 30%～90% B; 2.2～3.2 min， 90% B; 3.2～3.5 min， 90%～10% B; 3.5～5.0 min， 10% B; 柱溫： 30℃; 進樣量： 2 μL。（3）電噴霧質(zhì)譜 電噴霧離子源; 正離子掃描; 離子源溫度： 150℃; 噴霧電壓： 5500 V; 氣簾氣流速： 30 psi， 霧化氣流速： 60 psi， 脫溶劑氣流速： 60 psi; 脫溶劑氣溫度： 600℃; 碰撞氣設(shè)置： 高。（4）多反應(yīng)監(jiān)測-信息關(guān)聯(lián)采集-增強子離子掃描復(fù)合模式（MRM-IDA-EPI） 掃描范圍： m/z 50～415; 掃描速度： 20000 Da/s; 碰撞能量： （35±15） V。 11種喹諾酮類化合物的色譜-質(zhì)譜分析參數(shù)見表2， 多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖1。

3 結(jié)果與討論

3.1 超分子溶劑萃取條件的優(yōu)化

3.1.1 單因素試驗 （1）烷基醇種類 選用兩親性有機溶劑四氫呋喃分別與碳原子數(shù)C5～C12的烷基醇（正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇、正十一醇和正十二醇）和水組合形成超分子溶劑，對11種喹諾酮類化合物進行萃取。如圖2A所示，11種物質(zhì)的萃取率隨著烷基醇碳原子數(shù)的增加，整體呈現(xiàn)下降的趨勢。反向膠束超分子溶劑萃取作用力主要包括烷基鏈的疏水相互作用和親水頭基的氫鍵作用。當(dāng)烷基醇碳鏈較長時，疏水相互作用占優(yōu)勢，適合萃取極性小的物質(zhì); 當(dāng)烷基醇碳鏈較短時，氫鍵作用占優(yōu)勢，適合萃取極性大的物質(zhì)[21]。隨著碳鏈長度的減小，超分子溶劑相給質(zhì)子能力會隨之提高，從而使分子間作用力增強，喹諾酮類化合物萃取率增加?？傮w而言，正己醇具有較好的萃取效果（萃取率為65.0%～113.1%），而正辛醇及碳鏈更長的烷基醇的萃取率較低。另一方面，喹諾酮類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)、哌嗪環(huán)、環(huán)丙烷等結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其空間位阻變大，短鏈烷基醇更容易克服空間位阻而與氫鍵位點結(jié)合，有助于提高萃取效率。因此， 最終選擇正己醇用于后續(xù)優(yōu)化試驗。（2）烷基醇用量 保持超分子溶劑總體積為40 mL， 四氫呋喃用量為4 mL， 分別選取正己醇用量為1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 mL進行了考察，結(jié)果見圖2B。當(dāng)正己醇用量大于2.5 mL時，樣品可獲得較好的萃取效率。（3）四氫呋喃用量 考察了四氫呋喃用量為2、4、6、8、10和12 mL（保持超分子溶劑總體積為40 mL及正己醇用量為2.5 mL）的萃取情況（圖2C）， 結(jié)果表明， 四氫呋喃用量在8～10 mL時可獲得較好的萃取效果。（4）渦旋時間 在超分子溶劑萃取過程中，通過渦旋振蕩可以加速超分子溶劑和目標(biāo)化合物之間充分混合，促進傳質(zhì)過程。比較了渦旋時間為1、2、3、5、7和9 min時的萃取效果（圖2D），當(dāng)渦旋時間在3～7 min時，可獲得較理想的萃取效果。通過單因素試驗確定各參數(shù)的大致優(yōu)化范圍后，通過正交試驗對超分子溶劑萃取條件進行進一步優(yōu)化。

3.1.2 正交試驗 當(dāng)同一因變量受到多種因素共同作用時，除需要考慮因素單獨對試驗結(jié)果的影響外，還應(yīng)考慮不同因素之間可能存在的交互作用。超分子溶劑的結(jié)構(gòu)、組成等主要受長鏈烷基醇或烷基酸、四氫呋喃和水比例的影響。其中，烷基醇或烷基酸的量影響超分子的結(jié)構(gòu)，而四氫呋喃的量影響超分子的組成，并存在V=aX·ebY的函數(shù)關(guān)系（式中， a和b為與烷基醇或烷基酸種類有關(guān)的常數(shù)，V為超分子體積，X為烷基醇或烷基酸的用量，Y為四氫呋喃的百分比）[19， 20]。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用L8（23）正交表考察優(yōu)化烷基醇種類、烷基醇用量和四氫呋喃用量三個因素以及它們之間的交互作用對11種喹諾酮類化合物的萃取效率的影響，每組條件做3次平行試驗。正交試驗因素水平表見表3。

11種喹諾酮類化合物的方差分析結(jié)果見電子版文后支持信息表S1，帕雷托圖、主效應(yīng)圖和交互作用圖分別見電子版文后支持信息圖S1、S2和S3。綜合單因素試驗和正交試驗結(jié)果，最終選用2.5 mL正己醇、8 mL四氫呋喃和29.5 mL水形成的超分子溶劑作為萃取溶劑。

3.1.3 主成分分析 采用SIMACA 13.0軟件將主成分分析引入構(gòu)效關(guān)系分析中，通過對方差分析結(jié)果p值進行統(tǒng)計分析（圖3），探究了烷基醇種類、烷基醇用量、四氫呋喃用量等7種因子之間可能的關(guān)系規(guī)律。由主成分分析圖和樹狀圖可見，烷基醇種類A和四氫呋喃用量C被聚類在一起，表現(xiàn)出對萃取率近似的影響水平。而烷基醇用量B與交互因素AC位于同一類別，表現(xiàn)出了與另外兩個單因素不同的影響水平。在交互因素中，AB和BC聚類在一起。三因素交互因素ABC在主成分分析圖和樹狀圖中均獨立為一枝?？傮w而言， 7種因子之間具有較強的交互性和關(guān)聯(lián)性，在條件優(yōu)化時，需要根據(jù)實際情況綜合考慮。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

3.2.1 色譜柱的選擇 分別考察了具有不同選擇性的色譜柱BEH C18、BEH Shield RP18、BEH phenyl、CSH Fluoro-phenyl和HSS C18的效果，結(jié)果表明，BEH C18色譜柱對11種氟喹諾酮類化合物呈現(xiàn)最佳的色譜峰形和信號響應(yīng)。因此，選擇BEH C18（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）作為色譜柱。

3.2.2 流動相的選擇 分別考察了反相色譜常用的有機相溶劑（甲醇、乙腈和甲醇-乙腈混合溶劑）與水、酸化水相（濃度為0.05%、0.1%、0.15%和0.2%的甲酸溶液）和堿性水相（濃度為0.01%、0.05%和0.1%的氨水溶液）組成的流動相體系。由于喹諾酮類藥物為兩性化合物，流動相pH值對目標(biāo)化合物色譜行為影響較大。當(dāng)在水相中加入氨水使其為堿性時，11種待測化合物在色譜柱上無保留; 而當(dāng)在水相中加入甲酸使其為酸性時，色譜峰形和信號強度均明顯改善。經(jīng)綜合比較，以乙腈-0.15%甲酸水溶液為流動相進行洗脫時，目標(biāo)物可獲得較好的色譜峰形、分離效果和信號響應(yīng)。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別將11種待測目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度均為20 ng/mL）以5 μL/min注入電噴霧離子源，各物質(zhì)在正離子模式下可得到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+。將其作為前體離子，再進行子離子掃描二級質(zhì)譜分析，選擇豐度較大的兩個碎片離子，其中豐度較高的一個碎片離子作為定量離子，另一個作為輔助定性離子。分別對去簇電壓、入口電壓、碰撞能量、出口電壓等質(zhì)譜參數(shù)進行了優(yōu)化。

三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜既保留了串聯(lián)四極桿的選擇性和靈敏度優(yōu)勢，也具有線性離子阱增強二級碎片離子定性功能。采用多反應(yīng)監(jiān)測-信息關(guān)聯(lián)采集-增強子離子掃描復(fù)合模式，單次進樣可同時得到用于定量的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖，以及用于輔助定性的不同碰撞能量復(fù)合二級質(zhì)譜圖。與傳統(tǒng)的三重四極桿掃描模式相比，增強了二級碎片子離子掃描，有利于提高復(fù)雜樣品基質(zhì)中痕量目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確定性能力。11種喹諾酮類化合物的增強子離子掃描質(zhì)譜圖見圖4。

3.4 質(zhì)譜裂解規(guī)律

與傳統(tǒng)的串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的子離子掃描方式不同，三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜的增強型子離子掃描所得到的質(zhì)譜圖為低、中和高三種碰撞能量下采集得到的疊加質(zhì)譜圖，包含的碎片離子信息更為豐富。分析11種喹諾酮類化合物的增強子離子掃描質(zhì)譜圖可見，喹諾酮類化合物呈現(xiàn)前體離子失去H2O、CO2、CO、HF的中性丟失和哌嗪環(huán)斷裂等裂解途徑，裂解位點主要涉及到C-3位的COOH、C-4位的CO、C-6位的F和C-7位的哌嗪環(huán)等，而且一般脫去羧基后均有哌嗪環(huán)結(jié)構(gòu)的兩種重排反應(yīng)，生成兩種不同的碎片離子，即[M+H-CO2-C2H3NR2]+和[M+H-CO2-C3H6NR2]+（R2代表哌嗪環(huán)上可能連接的基團）。以環(huán)丙沙星為例，其裂解途徑見圖5。

3.5 方法學(xué)考察

3.5.1基質(zhì)效應(yīng)評估 由于血液基質(zhì)復(fù)雜，可能會對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度造成干擾。對方法的基質(zhì)效應(yīng)進行了考察，11種待測喹諾酮類化合物的基質(zhì)效應(yīng)為92.6%～115.9%，表明采用超分子溶劑分散液液微萃取前處理方法，可較好地消除血液樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響。

3.5.2線性范圍、檢出限及定量限 在優(yōu)化的條件下，測定一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，11種喹諾酮類藥物在各自濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R）大于0.998。分別以3倍信噪比和10倍信噪比計算方法的檢出限和定量限，檢出限為0.1～0.8 μg/L，定量限為0.4～2.0 μg/L（表4）。

表5列出了本方法與文獻報道的檢測方法的比較結(jié)果。與傳統(tǒng)的液液萃取法和固相萃取法相比，本方法的有機溶劑用量明顯減少，降低了對環(huán)境和操作人員的危害; 檢測靈敏度與之相當(dāng)或有所提高，但樣品前處理步驟則更加簡便快速，萃取與凈化過程同步完成，避免了試驗誤差和樣品損失。另一方面，本方法采用多反應(yīng)監(jiān)測-信息關(guān)聯(lián)采集-增強子離子掃描復(fù)合模式，提高了復(fù)雜樣品基質(zhì)中痕量目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確定性能力。

3.6實際樣品分析

采用本方法對來自淡水魚（鯽魚、草魚、鯉魚、武昌魚），家禽（雞、鴨）和家畜（牛、豬）的共12個血液樣品進行了檢測，均未檢出待測喹諾酮類藥物殘留。

以經(jīng)測定不含待測物的血液樣品為空白基質(zhì)，分別添加低中高3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進行測定，每個水平平行操作6次，計算加標(biāo)回收率。結(jié)果表明，11種喹諾酮類化合物的平均回收率為70.8%～115.2%， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～11.5%（表6）。

4 結(jié) 論

建立了超分子溶劑分散液液微萃取結(jié)合超高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜測定血液中11種喹諾酮類藥物殘留的分析方法，通過單因素和正交試驗考察了影響萃取效果的烷基醇種類與用量、四氫呋喃用量等關(guān)鍵因素，并進行了相關(guān)的統(tǒng)計學(xué)分析。在最佳條件下，利用多反應(yīng)監(jiān)測-信息關(guān)聯(lián)采集-增強子離子掃描復(fù)合模式測定11種待測化合物的檢出限為0.1～0.8 μg/L，定量限為0.4～2.0 μg/L; 在低中高3個加標(biāo)水平下的平均回收率為70.8%～115.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～11.5%。

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Determination of 11 Kinds of Quinolones Residues in Blood

by Ultra-Performance Liquid Chromatography-Hybrid

Triple Quadrupole-Linear Ion Trap Mass Spectrometry

WANG Chun1，2， YUAN Wen-Feng1， GU Chuan-Kun2， WANG Chang-Hai*2， MA Qiang

1（Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100176， China）

2（College of Resources and Environmental Sciences， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract A method for determination of 11 kinds of quinolones residues in blood was developed using supramolecular solvent-based dispersive liquid-liquid microextraction followed by ultra-performance liquid chromatography-hybrid triple quadrupole-linear ion trap mass spectrometry. The supramolecular solvent was prepared with hexanol as extraction solvent and tetrahydrofuran as dispersing agent for dispersive liquid-liquid microextraction of blood samples. The main parameters such as the composition and amount of supramolecular solvent and vortex time were systemically investigated by both single factor and orthogonal experiments in combination with statistical analyses. Chromatographic separation was performed on a Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column （50 mm×2.1 mm， 1.7 μm） with mobile phases of acetonitrile and 0.15% aqueous formic acid solution. Data acquisition was carried out in multiple reaction monitoring-information dependent acquisition-enhanced product ion mode for qualitative and quantitative analyses. The 11 kinds of quinolones exhibited good linearity in their respective linear ranges， with correlation coefficients of better than 0.998. The limits of detection and quantitation were in the range of 0.1-0.8 μg/L and 0.4-2.0 μg/L， respectively. The average recoveries at low， medium， and high spiked levels ranged from 70.8% to 115.2% with relative standard deviations of 3.0%-11.5% （n=6）.

Keywords Ultra-performance liquid chromatography-hybrid triple quadrupole-linear ion trap mass spectrometry;? Supramolecular solvent;? Dispersive liquid-liquid microextraction;? Quinolones