張軍波, 呂穎, 劉仲偉, 潘軍強， 殷艷蓉

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 周圍血管科， 陜西 西安 710061； 2.西安交通大學(xué)第三附屬醫(yī)院&陜西省人民醫(yī)院 心內(nèi)科， 陜西 西安 710068； 3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 陜西 西安 710061)

心房顫動(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見的心律失常之一，約20%的中國成年人罹患AF，并隨年齡增長而增加[1]。血栓栓塞是AF患者最常見的并發(fā)癥，也是AF患者致死、致殘的重要原因[2]。心臟纖維化是AF最重要也最顯著的病理改變，主要表現(xiàn)為心臟膠原蛋白沉積、心肌排列紊亂及心臟膠原比例的改變[3]。纖維化能破壞細胞間縫隙連接，心房肌被分割包繞，使得生理電信號不能順利傳導(dǎo)，形成多個折返環(huán)路，從而引發(fā)和維持AF[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)纖維化可有助于預(yù)防AF的復(fù)發(fā)[4]。過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARα)是核受體超家族的成員，是脂肪酸平衡的主要調(diào)節(jié)因子，主要在肝臟、腎臟及心臟等高代謝器官中表達[5]，具有保護心臟的作用[6]，參與了心臟纖維化過程[7]。既往的研究多基于動物心臟標(biāo)本，對人群的研究較少，本文采用HE及Masson染色觀察AF患者心房組織纖維化情況，采用實時熒光定量PCR(Realtime-PCR)法測定心房組織中PPARαmRNA表達，分析AF患者心肌中PPARα的表達與心肌纖維化的關(guān)系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料及試劑

1.1.1一般資料 選取2012年5-8月在心臟外科行人工心臟瓣膜置換術(shù)的風(fēng)濕性心臟瓣膜病患者81例，排除合并肝功能衰竭、腎功能衰竭、甲狀腺功能亢進癥、高血壓及各種類型的心肌病患者，排除合并結(jié)締組織病、風(fēng)濕熱活動期及腫瘤患者。81例患者按心電圖表現(xiàn)分為AF組(n=38)及竇性心律組(n=43，持續(xù)竇性心律無AF病史患者)。

1.1.2主要試劑 正反向引物及測序引物由上海尼桑生物公司合成，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自Takara公司，其余均為國產(chǎn)分析純。PTC-200DNA擴增儀為美國MJ公司產(chǎn)品，XSP-2CA生物顯微鏡和IMP-2型倒置相差生物顯微鏡均來自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1右心房組織學(xué)觀察 采用HE及Masson染色法，選取手術(shù)中廢棄的右心房右心耳組織，清洗后液氮保存；分為3份，一份用于檢測PPARα mRNA表達，2份用于組織學(xué)觀察。(1)HE染色，取右心耳組織，經(jīng)固定、脫水、OCT包埋速凍后進行冰凍切片及HE染色封片，鏡下觀察染色情況；(2)Masson染色，取右心耳組織，切片晾置甲醇固定后，分別經(jīng)蘇木素染色、鹽酸酒精分化、品紅復(fù)染、沖洗后苯胺藍復(fù)染、冰醋酸固定、酒精脫水、二甲苯透明后封片，鏡下觀察染色情況。

1.2.2PPARαmRNA表達 采用Realtime-PCR，所有用品經(jīng)預(yù)防RNA酶污染處理后，取右心耳組織提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用Primer primier 5.0軟件，設(shè)計引物序列，內(nèi)參hGAPDH上游引物序列為5′-TCATGGGTGTGA ACCATG AGA A-3′、下游引物序列為5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG T-3′，PPARα上游引物序列為5′-CGAATGTAGAATCTGCGGGG-3′、下游引物序列為5′-CATCCCGACAGAAAGGCACT-3′。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，56 ℃延伸30 s，擴增 40個循環(huán)后收集數(shù)據(jù)，繪制動力學(xué)曲線讀取 Ct值。將各組目的基因的Ct值與管家基因hGAPDH的Ct 值相減得△Ct，擴增重復(fù) 3 次，計算出各組PPARαmRNA 的表達，進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 右心房組織學(xué)觀察

染色結(jié)果顯示，AF組患者心房組織纖維化較竇性心律組加重，HE染色可見(圖1A-B)，竇性心律組心房組織排列有序，心肌細胞間有少量纖維組織，而AF組的心房組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂，心肌細胞肥大，排列不勻，可見組織間空隙較多，細胞核濃染，大小不一，細胞間隙可見明顯纖維組織增生。Masson染色可見(圖1C-D)膠原纖維呈藍色，心肌細胞胞質(zhì)、肌纖維和紅細胞呈紅色，而心肌細胞核呈藍褐色；竇性心律組患者心房肌細胞排列均勻，肌細胞間隙可見少量藍色膠原纖維組織，而AF組患者心房肌細胞肥大，排列較稀疏，可見藍色膠原纖維組織分割包繞褐色的心房肌細胞，細胞間間隙增大，其中藍色膠原纖維組織較竇性心律患者明顯增多。

注：A、B為HE染色，C、D為Masson染色；A、C為竇性心律組，B、D為AF組。圖1 兩組患者右心房組織(HE、Masson染色，×200)Fig.1 Right atrial tissue of both group patients

2.2 PPARα mRNA相對表達水平

2.2.1擴增曲線和溶解曲線PPARαmRNA擴增曲線拐點明確，整體擴增曲線平行性較好，基線較水平，無明顯上揚，各管的擴增曲線平行性好，表明各反應(yīng)管的擴增效率相近；溶解曲線僅出現(xiàn)一個有效峰值，提示產(chǎn)物特異性良好。見圖2。

圖2 PPARα mRNA擴增曲線及溶解曲線Fig.2PPARα mRNA amplification curve and melt curve

2.2.2PPARαmRNA相對表達水平 如圖3所示，AF組2-ΔΔCT=0.36±0.07，竇性心律組2-ΔΔCT=1.00±0.16， AF組PPARαmRNA相對表達水平明顯低于竇性心律組，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.61，P=0.003)。提示AF患者右心房組織PPARαmRNA的相對表達水平較竇性心律患者低。

注： (1)與AF組比較，P<0.01。圖3 兩組患者PPARα mRNA相對表達水平Fig.3 Relative expression level of PPARα mRNA of both groups

3 討論

引起AF的原因眾多，老年退行性改變、長期高血壓、甲狀腺功能亢進等都可以引起AF[8]。目前將外科換瓣術(shù)后或風(fēng)濕性心臟瓣膜病，尤其是二尖瓣狹窄相關(guān)的AF稱作瓣膜性AF[9]。AF患者的卒中的風(fēng)險是無AF患者的6倍，當(dāng)二尖瓣狹窄合并AF時，這個風(fēng)險增加到15倍[10]。

本研究結(jié)果證實瓣膜性AF患者右心房纖維化程度較正常對照組明顯加重，無論HE染色還是針對纖維組織的Masson染色均發(fā)現(xiàn)，竇性心律組患者的右心房組織內(nèi)心房肌細胞排列均勻，細胞間隙少量藍色膠原纖維組織，而瓣膜性AF患者心房肌細胞肥大，排列紊亂，被大量膠原纖維組織分割包繞。已有研究證實，AF與心肌纖維化常常伴隨發(fā)生，在孤立性AF患者心房活檢標(biāo)本中也證實，75%的患者存在明顯的心肌纖維化[11]。另一項長期快速起搏導(dǎo)致AF的模型研究證實，心肌纖維化程度和AF密切相關(guān)[12]。對于人群孤立性AF的研究，也證實初始心房正常大小的患者在隨訪20個月里心房發(fā)生了明顯的擴大[13]。在犬AF模型的研究發(fā)現(xiàn)AF可以誘發(fā)并促進心房擴大進程，同時導(dǎo)致心肌纖維化進行性加重[14]。以上研究結(jié)果提示，心肌纖維化的病理過程啟動后，隨著纖維化的加重，可以繼續(xù)促進AF，這形成了一個惡性循環(huán)[15]。

PPARα能改善血脂對心肌的作用，主要機制為PPARα刺激脂蛋白脂酶表達，促進脂蛋白釋放脂肪酸顆粒和隨后的吸收[16]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)一些促炎性細胞因子的產(chǎn)生，這可能促進與許多疾病狀態(tài)相關(guān)的病理老化，給老年小鼠服用能夠激活PPARα的藥物后，可以恢復(fù)細胞的氧化還原平衡，降低組織脂質(zhì)過氧化作用，持續(xù)消除激活的核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)并抑制炎性因子如血管內(nèi)皮細胞黏附分子-1、血小板內(nèi)皮細胞黏附分子和細胞間黏附分子-1的產(chǎn)生[17]。研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸甲酯可以激活小鼠PPARα的表達，促進β-氧化蛋白和基因表達，進而改善非酒精性脂肪肝[18]。對大鼠肝纖維化的研究發(fā)現(xiàn)，PPARα和PPARγ雙激動劑可以通過抑制瘦素、轉(zhuǎn)化生長因子β1和血小板衍生生長因子BB，從而降低金屬蛋白酶組織抑制劑-1的表達，從而發(fā)揮抗纖維化的作用[19]。對心臟研究發(fā)現(xiàn)，PPARα激動劑非諾貝特可以預(yù)防血管緊張素灌流大鼠的心肌炎癥，在減少炎癥因子的表達同時，可以減少轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達、減少膠原沉積并改善纖維化[20]；還可以抑制腹主動脈結(jié)扎導(dǎo)致壓力超負荷大鼠心肌膠原和內(nèi)皮素-1的表達，改善心肌纖維化[21]。PPARα激活后可以通過抑制內(nèi)皮素-1改善單腎切除高血壓大鼠左心室的心肌纖維化，但對于左心室心肌肥厚作用不大[22]。對于缺血性心肌病導(dǎo)致的心力衰竭患者行心臟移植術(shù)中取得的人體標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)，心衰的心室中纖維化加重，而相對與正常的心臟，衰竭心臟的PPARα和PPARγ選擇性的激活，在維持心房形態(tài)方面起了重要的作用[23]。

綜上所述，在瓣膜性AF患者的心房組織中，纖維化明顯加重，而PPARα的表達較竇性心律人群下降，提示瓣膜性AF患者的心房組織纖維化明顯加重，可能與心房組織的PPARα下降有關(guān)。但還需要進一步的研究證實。