楊英

【摘 要】目的：探討多重PCR快速檢測(cè)在化妝品中三種致病菌中的應(yīng)用效果。方法：參考已有的大腸桿菌phoA基因、銅綠假單胞菌外膜蛋白基因oprL與金黃色葡萄球菌特異性序列Smal中引物，對(duì)化妝品中常見(jiàn)的常見(jiàn)的三種致病菌采用PCR進(jìn)行檢測(cè)、分析。結(jié)果：多重PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示：根據(jù)篩選的3對(duì)特異性引物對(duì)3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株、3個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)菌株及6個(gè)污染菌株進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)3對(duì)引物均能對(duì)應(yīng)的菌株發(fā)生特異性結(jié)合，出現(xiàn)一條預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度一致的清晰的條帶，6株其他菌株均未出現(xiàn)增出條帶。結(jié)論：利用多重PCR快速檢測(cè)用于化妝品三種致病菌檢測(cè)中效果理想，值得推廣應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】多重PCR;快速檢測(cè);化妝品;致病菌;應(yīng)用效果

【中圖分類號(hào)】R256.21【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1005-0019（2019）22--01

臨床研究表明：微生物指標(biāo)是化妝品衛(wèi)生質(zhì)量合格與否的重要影響因素[1]。我國(guó)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中明確規(guī)定每克或每毫克化妝品中不得檢出糞便大腸菌群、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌[2]。本文以病例隨機(jī)對(duì)照展開(kāi)，探討多重PCR快速檢測(cè)在化妝品中三種致病菌中的應(yīng)用效果，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 小型高速離心機(jī)（Eppendorf）、紫外分光光度計(jì)（METASH UV5200PC）、Mastercycler nexus GSX1梯度PCR儀（Eppendorf）、凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）、細(xì)菌DNA提取試劑盒、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（廣州環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.2 引物的合成與設(shè)計(jì) 本研究中所需的引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物見(jiàn)表1。

1.3 方法 （1）RNA提取。取待測(cè)化妝品，加入500uL trizol充分混合均勻后加入氯仿0.2mL，15s劇烈震蕩，常溫下靜置2-3min，15min離心，離心力1825g，獲得三層液體（上層為水相、中間層與下層為有機(jī)相）。取RNA沉淀，轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入0.5mL異丙醇，混合均勻后放置在-20℃冰箱中，10min離心，離心力1194g獲得RNA沉淀。充分洗滌RNA，加入250uL DEPC與750uL乙醇，利用乙醇完成沉淀的沖洗，5min離心，離心力2315g，取沉淀放入工作臺(tái)上進(jìn)行20min干燥。利用紫外分光度儀檢測(cè)RNA濃度并完成RNA提純（以Rnase作為空白對(duì)照），在A260下測(cè)定吸光度值。（2）PCR測(cè)定。多重PCR快速測(cè)定化妝品中三種致病菌。設(shè)定PCR反應(yīng)條件：30℃，10min;42℃，30 min;99℃，5 min;5℃，5 min，連續(xù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃下完成10min延長(zhǎng)，β-actin為內(nèi)對(duì)照[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS18.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料行檢驗(yàn)，采用n（%）表示，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，采用（）表示，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

多重PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示：根據(jù)篩選的3對(duì)特異性引物對(duì)3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株、3個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)菌株及6個(gè)污染菌株進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)3對(duì)引物均能對(duì)應(yīng)的菌株發(fā)生特異性結(jié)合，出現(xiàn)一條預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度一致的清晰的條帶，6株其他菌株均未出現(xiàn)增出條帶，見(jiàn)圖1。

3 討論

近年來(lái)，多重PCR快速檢測(cè)在化妝品三種病菌檢測(cè)中得到應(yīng)用，且效果理想。本研究中，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)3對(duì)引物均能對(duì)應(yīng)的菌株發(fā)生特異性結(jié)合，出現(xiàn)一條預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度一致的清晰的條帶，6株其他菌株均未出現(xiàn)增出條帶，說(shuō)明多重PCR能實(shí)現(xiàn)化妝品中三種病菌的檢測(cè)?；瘖y品微生物污染不僅會(huì)給企業(yè)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損傷，亦會(huì)嚴(yán)重危害人類的健康，通過(guò)多重PCR檢測(cè)方法能同時(shí)、快速、準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)化妝品中大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌測(cè)定，有助于提高化妝品的使用及安全。

綜上所述，利用多重PCR快速檢測(cè)用于化妝品三種致病菌檢測(cè)中效果理想，具有快速、特異性等優(yōu)點(diǎn)，值得推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

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