陸洪省 張雪 高宇婷 孫珮銘 邱萌萌

（山東科技大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，青島 266590）

土傳病害是一類重要的植物病害，主要以土壤為傳播媒介，從植物的根部侵染植株，最后引起植株整株死亡，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的損失［1］。在治理土壤病蟲害的過(guò)程中，長(zhǎng)期大量使用高毒、高殘留的化學(xué)農(nóng)藥對(duì)蔬菜、糧食作物等種植土壤造成了非常嚴(yán)重的污染。由于化學(xué)藥劑對(duì)環(huán)境污染問(wèn)題日益突出，生物防治越來(lái)越引起人們的關(guān)注［2］。

木霉屬（Trichoderma）作為一類重要的生防真菌，廣泛存在于自然界中，具有適應(yīng)性強(qiáng)、存在范圍廣和高效等優(yōu)點(diǎn)［3］。木霉屬包括多個(gè)菌種，如綠色木霉（Trichoderma viride）、康寧木霉（Trichoderma koningii）、棘孢木霉（Trichoderma asperellum）、深綠 木 霉（Trichoderma atroviride）、 哈 茨 木 霉（T.harzianum）、長(zhǎng)枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）等，其中哈茨木霉菌是木霉菌屬中應(yīng)用最廣的一個(gè)菌種。哈茨木霉能夠有效的防治鐮刀菌（Fusarium）、腐 霉 菌（Pythium）、 立 枯 絲 核 菌（Rhizoctonia solani）、人參銹腐病菌（Cylindrocarpon destructans）、禾谷絲核菌（Rhizoctonia ce-realis）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）等引起的植物白絹病、幼苗枯病、疫霉病、人參銹腐病、小麥紋枯病、番茄灰霉病等，是多種植物病原菌的拮抗菌和寄生菌，已作為生防制劑廣泛用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域［4-8］，而且哈茨木霉可以產(chǎn)生多種能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和提高植物的抗病性的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物［9-10］。鏈格孢是經(jīng)濟(jì)上重要的真菌屬之一。大多數(shù)種類兼性寄生于植物上，引起多種經(jīng)濟(jì)植物病害，造成田間和產(chǎn)后損失。萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）對(duì)鏈格孢有明顯的拮抗作用［11］；解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、放線菌（Actinomycesbovis）、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）和哈茨木霉（T. harzianum）突變菌株對(duì)茄鏈格孢菌均有明顯的抑制效果［12-16］。

本研究從番茄根腐爛病發(fā)病嚴(yán)重的土壤中分離到一株哈茨木霉菌株，并用該哈茨木霉分別對(duì)鏈格孢菌和茄鏈格孢菌進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)，此外，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)哈茨木霉發(fā)酵液中的抑菌成分進(jìn)行測(cè)定，并分析哈茨木霉發(fā)酵液對(duì)土壤中細(xì)菌菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中供試病原菌為鏈格孢菌（Alternaria spp.）和茄鏈格孢菌（Alternaria solani），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，保存于PDA培養(yǎng)基上以備使用；所用土壤為番茄根部腐爛嚴(yán)重的土壤，取自山東棗莊某蔬菜大棚。

1.2 方法

1.2.1 哈茨木霉的分離與培養(yǎng) 分離過(guò)程：用PDA固體平板培養(yǎng)基對(duì)哈茨木霉進(jìn)行分離，培養(yǎng)基組成：去皮馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 15-20 g、蒸餾水 1 L、pH值自然。分離方法：稱取1 g番茄根部腐爛嚴(yán)重的土壤加到盛有100 mL無(wú)菌水的燒杯中，攪拌均勻后靜置6 h，取上層土壤浸出液20 μL涂布到PDA固體平板培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 d，長(zhǎng)出肉眼可識(shí)別的菌落后，挑取與哈茨木霉形態(tài)、顏色、透明度一致的單個(gè)菌落重復(fù)劃線，直至確認(rèn)為純菌。

1.2.2 哈茨木霉的系統(tǒng)分類學(xué)鑒定 對(duì)分離到的菌株進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增，所用引物為通用引物 ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCCG） 和 ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）。擴(kuò)增體系為：DNA模板 1 μL、2×PCR Master Mix 25 μL、引物 ITS1 和ITS4 各 1 μL、ddH2O 22 μL。擴(kuò)增條件為 ：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃復(fù)性10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃條件下保存。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL loading buffer混勻，加入1%瓊脂糖凝膠孔中，用DNA Marker作對(duì)照，在1×TAE電泳緩沖液中電泳，以凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，委托睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)得序列在GenBank中用Blast程序進(jìn)行相似性分析［17］。用MEGA 5.1進(jìn)行聚類分析，采用鄰近法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［18］。

1.2.3 哈茨木霉發(fā)酵液制備 將分離純化出的哈茨木霉菌株接種到PDA固體平板培養(yǎng)基，28℃條件下培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌水沖洗上述PDA平板，得到孢子懸浮液，將孢子懸浮液加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使其在發(fā)酵培養(yǎng)基中濃度為1×107個(gè)/mL［19］。發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖 20 g、KH2PO41.2 g、MgSO4·H2O 0.6g、維生素 B10.008 g、蒸餾水 1 L［20］，28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，得到發(fā)酵液。發(fā)酵液離心（8000 r/min）10 min取上清液，用0.22 μm的濾頭過(guò)濾，得到無(wú)菌發(fā)酵液，待用。

1.2.4 哈茨木霉發(fā)酵液成分的GC-MS分析 發(fā)酵液成分的提取步驟：取上述制備好的哈茨木霉發(fā)酵液，按發(fā)酵液∶乙醇=1∶3（V/V）比例浸提，50℃水浴、攪拌使之溶解，溶解后按溶液∶石油醚=1∶3（V/V）比例浸提，留取水層并分別用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)一步萃取，對(duì)萃取得到的有機(jī)層濃縮，再用吐溫-80溶解并分別標(biāo)志為A、B、C［21］。對(duì)A、B、C三種萃取物分別用無(wú)水硫酸鈉脫水后用氣質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent 5977B）測(cè)定。色譜條件：毛細(xì)管色譜 柱 HP-5MS（5% Phenyl Methyl Silox，325℃，30 m × 250 μm × 0.25 μm），汽化室溫度 270℃，載氣為氦氣，柱流量1 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。60℃柱溫維持 4 min，然后 10℃/min升高到150℃維持2 min，然后以5℃/min升高到260℃維持15 min。進(jìn)樣口溫度260℃，檢測(cè)器溫度280℃。質(zhì)譜條件：電離源EI，電子能量70 ev，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，掃描范圍全掃描。

1.2.5 哈茨木霉發(fā)酵液對(duì)土壤中細(xì)菌菌群的影響 將10 mL上述1.2.3中制備的哈茨木霉發(fā)酵液和10 mL番茄根腐爛病發(fā)病嚴(yán)重的土壤浸出液（1 g土壤加入到100 mL無(wú)菌水，攪拌、靜置而來(lái)）接種到200 mL哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)基中，作為實(shí)驗(yàn)組；未接種哈茨木霉發(fā)酵液只接種發(fā)病土壤浸出液的為對(duì)照組，兩種處理均在28℃條件下培養(yǎng)10 d，然后委托上海生工生物工程股份有限公司對(duì)兩種處理液進(jìn)行高通量宏基因組測(cè)序。

1.2.6 哈次木霉菌株對(duì)兩種供試病原菌的拮抗實(shí)驗(yàn) 采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法分別對(duì)鏈格孢菌、茄鏈格孢菌和上述分離純化到的菌株進(jìn)行平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，方法：分別挑取直徑7 mm的鏈格孢菌菌塊和茄鏈格孢菌菌塊放置到新的PDA平板一側(cè)，距平板邊緣2cm左右的位置上，再將分離純化后的菌塊分別放置到鏈格孢菌菌塊和茄鏈格孢菌菌塊的相對(duì)側(cè)的PDA平板上，距平板邊緣同樣為2 cm左右的位置，作為實(shí)驗(yàn)組；單獨(dú)接種兩種病原菌菌塊的平板作為對(duì)照組，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)5 d，每組做3次平行處理，每天記錄病原菌及哈茨木霉的生長(zhǎng)狀況，測(cè)量菌落半徑。平板培養(yǎng)第5 d時(shí)分別計(jì)算哈茨木霉對(duì)兩種病原菌的抑制率［8，22］。

拮抗系數(shù)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（5級(jí)）Ⅰ級(jí)：哈茨木霉菌絲長(zhǎng)滿平皿；Ⅱ級(jí)：2/3平皿面積 ≤ 哈茨木霉菌絲面積 ＜ 100%平皿面積；Ⅲ級(jí)：1/3平皿面積 ≤ 哈茨木霉菌絲面積 ＜ 2/3平皿面積；Ⅳ級(jí)：0 ＜ 哈茨木霉菌絲面積 ＜ 1/3 平皿面積；Ⅴ級(jí)：病原菌菌絲長(zhǎng)滿平皿。

抑制率（%）=（病原菌對(duì)照菌落半徑-病原菌對(duì)峙菌落半徑/病原菌對(duì)照菌落半徑）×100%

2 結(jié)果

2.1 菌株的菌落形態(tài)

菌株在PDA培養(yǎng)基生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)3 d時(shí)出現(xiàn)白色絮狀菌絲且鋪滿整個(gè)平板，之后菌絲逐漸變?yōu)榫G色，培養(yǎng)6 d時(shí)菌絲變?yōu)榘稻G色，無(wú)明顯氣味，菌落形態(tài)特征與哈茨木霉菌株基本一致（圖1）。

圖1 菌落的形態(tài)觀察

2.2 菌株的系統(tǒng)分類學(xué)鑒定

PCR擴(kuò)增后的DNA序列通過(guò)凝膠電泳確認(rèn)后（長(zhǎng)度625 bp）進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中各菌株序列進(jìn)行相似性分析，與T. harzianumCGAJ1T-1菌株的一致性達(dá)100%。用MEGA5.1軟件對(duì)同源性較高的序列進(jìn)行序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示，該序列和T. harzianumCGAJ1T-1菌株在同一分支，結(jié)合其生物學(xué)特性及形態(tài)學(xué)特征，確定該菌株為哈茨木霉，并命名為Trichoderma harzianumSKD-ZX-1（序列號(hào) ：LC485252）。

2.3 哈茨木霉發(fā)酵液抑菌組分分析

用氣相色譜質(zhì)譜連用儀對(duì)提取物A、B、C進(jìn)行分析［21］，色譜圖如圖3-5所示。得到的質(zhì)譜圖經(jīng)NIST02質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對(duì)，確定其組分。哈茨木霉發(fā)酵液提取物的主要化學(xué)組分包括醇類、酯類、烷類、烯酸類等，其中化合物名稱及相對(duì)含量見(jiàn)表1-3。

由相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)［23］，鄰苯二甲酸酯類具有較好的抑菌效果，而在A和C兩種提取物中均含有鄰苯二甲酸酯類（表1和表3），其中提取物A中鄰苯二甲酸二異丁酯（圖3，7號(hào)峰）占出峰總量的5.57%，鄰苯二甲酸二丁酯（圖3，8號(hào)峰）占出峰總量的27.33%，鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（圖3，16號(hào)峰）占出峰總量的1.6%。提取物C中鄰苯二甲酸二異丁酯（圖5，7號(hào)峰）占出峰總量的2.194%，鄰苯二甲酸二丁酯（圖5，9號(hào)峰）占出峰總量的1.33%。其他物質(zhì)是否有抑菌作用還有待研究。

圖2 基于ITS1+ITS4基因序列構(gòu)建的菌株T. harzianum SKD-ZX-1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 分步提取法提取物A的氣相色譜圖

圖4 分步提取法提取物B的氣相色譜圖

圖5 分步提取法提取物C的氣相色譜圖

2.4 哈茨木霉發(fā)酵液對(duì)土壤中細(xì)菌群落的影響

2.4.1 哈茨木霉發(fā)酵液對(duì)土壤中細(xì)菌菌群多樣性的影響 由表4可知，加入哈茨木霉發(fā)酵液的實(shí)驗(yàn)組樣品中含有1505個(gè)OTUs，而未加入哈茨木霉發(fā)酵液的對(duì)照組含有805個(gè)OTUs，說(shuō)明哈茨木霉發(fā)酵液可增加土壤中細(xì)菌菌群的種類；加入哈茨木霉發(fā)酵液的實(shí)驗(yàn)組樣品中Ace和Chao指數(shù)均高于對(duì)照組，

說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組中細(xì)菌物種總數(shù)高于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組樣品Shannon指數(shù)小于對(duì)照組，而Simpson指數(shù)大于對(duì)照組，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組樣品中細(xì)菌的多樣性低于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組覆蓋度指數(shù)微高于對(duì)照組，且均在0.90以上，說(shuō)明采集的樣品足以反應(yīng)土壤中細(xì)菌情況。

表1 分步提取法提取物A的化學(xué)成分分析

表2 分步提取法提取物B的化學(xué)成分分析

表3 分步提取法提取物C的化學(xué)成分分析

2.4.2 哈茨木霉發(fā)酵液對(duì)土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響 通過(guò)宏基因組16S rDNA的物種分類分析，得到以下結(jié)果（表5、表6）。由表5可知，在門分類水平上，加入哈茨木霉發(fā)酵液的實(shí)驗(yàn)組中變形菌門的相對(duì)豐度變化較明顯，有明顯的提高，優(yōu)勢(shì)菌群厚壁菌門在實(shí)驗(yàn)組中豐度大大的降低，擬桿菌門和放線菌門變化較小。

表4 各組樣品多樣性指數(shù)

由表6可知，在屬分類水平上，腸桿菌屬、假單胞菌屬和梭菌屬3個(gè)菌屬的豐度占整體的90%以上。與對(duì)照組相比，加入哈茨木霉發(fā)酵液組腸桿菌屬提高46%，而假單胞菌屬和梭菌屬分別降低5.28%和36.1%，腸桿菌屬顯著增加，而梭菌屬顯著降低。

2.5 哈茨木霉對(duì)兩種供試病原菌的拮抗結(jié)果分析

從哈茨木霉和兩種病原菌的對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中觀察到，哈茨木霉對(duì)兩種病原菌均有很好的抑制效果，對(duì)峙培養(yǎng)3 d時(shí)哈茨木霉和兩種病原菌開(kāi)始接觸，哈茨木霉在PDA平板上生長(zhǎng)迅速，病原菌的生長(zhǎng)均明顯受到抑制；5 d時(shí)，哈茨木霉已占據(jù)整個(gè)PDA平板，分別將兩種病原菌包圍，兩種病原菌邊緣塌陷，長(zhǎng)勢(shì)被削弱，幾乎不再生長(zhǎng)（圖6）。根據(jù)抑制率公式（1.2.6），分別測(cè)量培養(yǎng)5 d時(shí)菌落直徑計(jì)算出哈茨木霉對(duì)鏈格孢菌和茄鏈格孢菌的抑制率均達(dá)到100%，拮抗系數(shù)為Ⅰ級(jí)（表7）。

表5 哈茨木霉發(fā)酵液對(duì)土壤中細(xì)菌在門水平上的豐度影響

表6 哈茨木霉發(fā)酵液對(duì)土壤中細(xì)菌在屬水平上的豐度影響（前10種）

表7 哈茨木霉對(duì)鏈格孢菌和茄鏈格孢菌的抑制作用

3 討論

研究表明，哈茨木霉對(duì)多種病原菌均有一定的抑制作用。哈茨木霉T28菌株對(duì)苗木立枯病3種病原菌，包括立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、德巴利腐霉均有一定的拮抗作用［24］；哈茨木霉TH-1菌株對(duì)小麥紋枯病有一定的防治效果，對(duì)小麥紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用［7］；哈茨木霉對(duì)番茄灰霉病、枯萎病、葉霉病和褐斑病進(jìn)行了重寄生［25］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)，研究了哈茨木霉對(duì)鏈格孢菌和茄鏈格孢菌的拮抗作用，其抑制率都相對(duì)較高，拮抗系數(shù)都達(dá)到Ⅰ級(jí)，有較好的抑制效果。

圖6 哈茨木霉與兩種致病菌的對(duì)峙培養(yǎng)

本研究通過(guò)高通量宏基因組測(cè)序分析了哈茨木霉發(fā)酵液對(duì)土壤中細(xì)菌菌落的影響，其中腸桿菌屬在加入哈茨木霉發(fā)酵液后豐度有大幅度提高，而假單胞菌屬和梭菌屬降低?？梢?jiàn)，哈茨木霉發(fā)酵液改變了土壤中細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)，并且有相關(guān)文獻(xiàn)表明哈茨木霉可以改變土壤中細(xì)菌的菌落結(jié)構(gòu)。生防菌哈茨木霉T4促進(jìn)了假單胞菌、芽孢桿菌、蒼白桿菌和中慢生根瘤菌的生長(zhǎng)，對(duì)西瓜根圍土壤的細(xì)菌群落有了明顯的影響［26］；哈茨木霉T23和土壤有益細(xì)菌放線菌、光合細(xì)菌和乳酸桿菌分別混合處理后，3種土壤有益細(xì)菌的數(shù)量均比單獨(dú)使用3種供試細(xì)菌的數(shù)量明顯增加，說(shuō)明哈茨木霉T23對(duì)3種供試細(xì)菌有一定的促進(jìn)生長(zhǎng)的作用［27］。對(duì)哈茨木霉發(fā)酵液進(jìn)行GC-MS分析后，其中得到醇類、酯類、烷類、烯酸類，有相關(guān)的研究表明，鄰苯二甲酸酯類有抑菌、抑藻和他感作用。鄰苯二甲酸二丁酯是一種對(duì)藻類具有較強(qiáng)的抑制能力的化感物質(zhì)，其對(duì)短裸甲藻的半效應(yīng)濃度為1.1 mg/L［28］；辣椒根系分泌物的主要化感物質(zhì)中有鄰苯二甲酸酯類，其中，鄰苯二甲酸二丁酯的含量最高［29］；廣玉蘭葉片浸提液對(duì)銅綠微囊藻有很好的抑制效果，提取物中有大量的抑藻活性物質(zhì)，其活性成分中有31.69%的鄰苯二甲酸單（2-乙基）己酯；紫莖澤蘭根系分泌化感物質(zhì)鄰苯二甲酸二丁酯在高濃度下（500，1000 mg/L）對(duì)有機(jī)磷細(xì)菌的生長(zhǎng)有抑制作用［30］。以上結(jié)果表明，本研究中分離到的哈茨木霉SKD-ZX-1對(duì)植物病害土壤中微生物的群體構(gòu)造具有明顯的影響，但該結(jié)果是在實(shí)驗(yàn)室土壤環(huán)境條件獲得，與作物實(shí)際生長(zhǎng)的土壤環(huán)境還有一定的差別，包括土壤中溫度、水分、光照等條件都會(huì)對(duì)哈茨木霉的作用產(chǎn)生一定的影響。因此，田間土壤實(shí)驗(yàn)將是下一步的研究工作。

4 結(jié)論

本研究從番茄根腐爛病嚴(yán)重的土壤中分離到一株哈茨木霉，并對(duì)其生防作用進(jìn)行研究表明，哈茨木霉SKD-ZX-1對(duì)鏈格孢菌和茄鏈格孢菌均有一定的抑制作用；其發(fā)酵液含有一定的抑菌成分并且可以改變土壤中細(xì)菌的菌落結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果表明，本研究中分離到的哈茨木霉SKD-ZX-1對(duì)植物病害土壤中微生物的群體構(gòu)造具有明顯的影響，但該結(jié)果是在實(shí)驗(yàn)室土壤環(huán)境條件獲得，與作物實(shí)際生長(zhǎng)的土壤環(huán)境還有一定的差別，包括土壤中溫度、水分、光照等條件都會(huì)對(duì)哈茨木霉的作用產(chǎn)生一定的影響。因此，田間土壤實(shí)驗(yàn)將是下一步的研究工作。