張巖 關(guān)菲菲 伍寧豐 田健

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，保定071000；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081）

幾丁質(zhì)又名甲殼素、甲殼質(zhì)，是一種由N-乙酰葡糖胺通過β-（1，4）糖苷鍵連接形成的多糖。廣泛分布于海產(chǎn)品蝦、蟹的外殼，真菌和藻類等植物的細(xì)胞壁中，同時(shí)也是節(jié)肢動(dòng)物，如大多數(shù)昆蟲的外骨骼的重要組成成分［1］。在自然界中，幾丁質(zhì)是繼纖維素之后的第二大含量豐富的多糖物質(zhì)［2］。該物質(zhì)由Henri Braconnot于1811年首次在真菌中發(fā)現(xiàn)［3］，但該物質(zhì)幾乎不溶于常用溶劑，從而嚴(yán)重限制了其商業(yè)應(yīng)用。幾丁質(zhì)經(jīng)幾丁質(zhì)脫乙酰酶（Chitin deacetylase，CDA）水解可得到易溶于酸的殼聚糖［4］。殼聚糖作為幾丁質(zhì)的衍生物，同屬于大分子多糖聚合物，同時(shí)是自然界中發(fā)現(xiàn)的唯一堿性多糖，具有極大的應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)前景。

在工業(yè)上，殼聚糖可用來制備水凝膠、纖維、納米粒子等物質(zhì)；根據(jù)其成膜性則可使紡織材料達(dá)到耐水洗、抗皺、抗靜電等效果［5］。在醫(yī)學(xué)上，由于其具有較好的生物相容性，生物降解性和無毒性［6］，常被用來制作動(dòng)脈支架、藥物緩釋微膠囊等材料［7］。作為天然食品添加劑，對(duì)肉制品［8］、果蔬制品［9］和海產(chǎn)品［10］等有顯著的保鮮作用。此外，還具有澄清果汁［11］、延緩淀粉老化和增加面包持水性［12］等功效，從而改善食品風(fēng)味和質(zhì)感。根據(jù)其與金屬離子結(jié)合能力和絮凝作用，可有效處理環(huán)境中的污水，同時(shí)易被降解不會(huì)造成二次污染［13］。其良好的持水性和成膜性，也使之在化妝品行業(yè)中有一定的應(yīng)用［14］。

目前工業(yè)生產(chǎn)中主要利用濃堿（40% NaOH）和高溫長(zhǎng)時(shí)間處理法脫去蝦蟹外殼中幾丁質(zhì)的乙酰基團(tuán)來制備殼聚糖［15］。該過程不僅會(huì)造成濃堿的大量浪費(fèi)，產(chǎn)生的工業(yè)廢水也會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。且該過程不易控制，生成的殼聚糖為脫乙酰度不同的混合物且質(zhì)量不穩(wěn)定。反應(yīng)過程耗時(shí)長(zhǎng)、耗能高［16］，增加了生產(chǎn)成本。而利用幾丁質(zhì)脫乙酰酶脫去幾丁質(zhì)的乙酰基團(tuán)是一種綠色高效的、條件可控的方法，該方法具有高度特異性，可定向得到所需降解產(chǎn)物，避免意外降解底物糖鏈的其它基團(tuán)［17］。

幾丁質(zhì)脫乙酰酶是指能夠脫去底物上乙?；鶊F(tuán)的酶，目前研究的脫乙酰酶的主要作用底物有幾丁質(zhì)、殼聚糖、殼寡糖等，底物不同，酶的種類，作用方式往往不同。本文通過搜集已發(fā)表的包括真菌、細(xì)菌及動(dòng)物等來源的脫乙酰酶基因序列，通過NCBI網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行BLAST分析，對(duì)含有特定CE4超家族、spore_pdaA超家族、uraD_N-term-dom超家族結(jié)構(gòu)域序列的酶進(jìn)行歸納。下面將從這一類酶的催化機(jī)制，反應(yīng)條件，金屬離子的影響等方面進(jìn)行闡述。

1 幾丁質(zhì)脫乙酰酶的催化機(jī)制

1.1 CE4超家族

CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.cazy.org/）中的碳水化合物脂酶4（Carbohydrate esterase 4，CE4）超家族，主要包括幾丁質(zhì)脫乙酰酶，細(xì)菌肽聚糖N-乙酰葡糖氨脫乙酰酶以及木聚糖脫乙酰酶等，這類酶可以移除乙酰基團(tuán)從而將N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）轉(zhuǎn)變?yōu)榘被咸烟牵℅lcN），該家族成員一般包含NodB同源結(jié)構(gòu)域和His-His-Asp金屬離子結(jié)合三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，屬于利用酸堿催化的金屬酶［18］。

1.1.1 CE4超家族水解底物特性 近年來，關(guān)于該類幾丁質(zhì)脫乙酰酶的研究主要集中在其底物的識(shí)別特性。2017年，挪威生命科學(xué)大學(xué)Liu等［19］從Aspergillus nidulansFGSC A4中鑒定出一種幾丁質(zhì)脫乙酰酶AnCDA（GenBank EAA66447），該酶對(duì)（GlcNAc）2有單端脫乙酰作用，對(duì)（GlcNAc）3-6則具有完全脫乙酰作用，對(duì)α-幾丁質(zhì)、β-幾丁質(zhì)也有一定活性，但對(duì)于GlcNAc無活性。同年，日本大學(xué)Hirano等［20］從Shewanella balticaATCC BAA-1091 中篩選出的SbCODs（GenBank ABN60929.1），與AnCDA具有相似的催化機(jī)制，即SbCODs對(duì)（GlcNAc）2的還原端進(jìn)行脫乙酰反應(yīng)，形成GlcNAc-GlcN，對(duì)GlcNAc無活性，但對(duì)（GlcNAc）3-4均有脫乙酰活性。另外來自于真菌灰蓋鬼傘（Coprinopsis cinerea）的幾丁質(zhì)脫乙酰酶CDA1（GenBank EAU83261.2）和CDA2（GenBank EAU83234.2）［21］也對(duì) GlcNAc均無反應(yīng)，對(duì)（GlcNAc）2和40%的脫乙酰殼聚糖有一定的脫乙酰作用，且當(dāng)幾丁質(zhì)粉末和膠體幾丁質(zhì)作為底物時(shí)無酶活。但這兩種酶對(duì)乙二醇幾丁質(zhì)（Glycol chitin）均有較高酶活。海洋節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）的幾丁質(zhì)脫乙酰酶ArCE4A（GenBank LT630322）［22］對(duì) GlcNAc、（GlcNAc）2、α-幾丁質(zhì)和 β-幾丁質(zhì)幾乎無活性，但對(duì)部分乙?；臍ぞ厶怯幸欢ǖ拿撘阴；钚?，且對(duì)乙酰木聚糖具有較高活性，脫乙酰度可達(dá)18.9%。同樣，來自Pestalotiopsissp.的幾丁質(zhì)脫乙酰酶 PesCDA（GenBank KY024221）［23］對(duì)膠體幾丁質(zhì)有輕微的脫乙酰作用，且該酶脫乙酰效果隨著底物乙酰度的增加而增加。當(dāng)以（GlcNAc）2-6作為底物進(jìn)行脫乙酰反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，該酶對(duì)于（GlcNAc）n（n＞3）時(shí)存在脫乙酰效果，但最終產(chǎn)物仍會(huì)保留3個(gè)乙酰基團(tuán)。與之相同的的是，根霉菌Rhizopus circinans分泌的幾丁質(zhì)脫乙酰酶RcCDA（GenBank EU086737）［24］，也僅對(duì)聚合度≥3的低聚物具有脫乙酰活性，這也與其它毛霉菌來源的脫乙酰酶相符。

然而與上述幾種酶都不同的是，來自于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的幾丁質(zhì)脫乙酰酶ScCDA2［25］除了可作用于（GlcNAc）2-6外，還可對(duì)膠質(zhì)幾丁質(zhì)、α-幾丁質(zhì)和β-幾丁質(zhì)3種均產(chǎn)生一定的脫乙酰作用。

來 源 于Vibrio Cholerae的VcCOD（GenBank WP_130350642）［26］通過對(duì)底物（GlcNAc）1-6測(cè)試發(fā)現(xiàn)該酶不能脫去GlcNAc中的乙?；鶊F(tuán)，底物為（GlcNAc）2時(shí)表現(xiàn)出最大酶活，且酶活隨著鏈長(zhǎng)的增加酶活逐漸降低。同樣，Pacheco等［27］通過對(duì)來自膠孢炭疽菌的幾丁質(zhì)脫乙酰酶研究發(fā)現(xiàn)，通過降低底物鏈長(zhǎng)有助于脫乙酰反應(yīng)，另外在酸性介質(zhì)中提高溶解度和降低底物結(jié)晶度有促進(jìn)脫乙酰效果。但ArCE4A在底物（GlcNAc）3-5中卻隨著聚合度的增加呈現(xiàn)酶活遞增趨勢(shì)，這與上述兩種酶對(duì)糖鏈長(zhǎng)度的偏好完全相反。

柄孢霉（Podospora anserina）中含有一種具有兩個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Chitin binding domain，CBD）的幾丁質(zhì)脫乙酰酶PaCDA（GenBank CAP60162），Hossbach等［28］通過研究去除一個(gè)或全部幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的PaCDA發(fā)現(xiàn)，不溶于水的膠質(zhì)殼五糖作為底物時(shí)含有CBDs的PaCDA比完全刪除該結(jié)構(gòu)域的PaCDA有更好的脫乙酰效果。表明CBDs有助于酶與不溶的底物進(jìn)行反應(yīng)。此外，該酶易作用于高度乙?；臍ぞ厶歉呔畚?，但無法使底物完全脫乙?；?。

1.1.2 CE4超家族結(jié)構(gòu)信息 通過對(duì)上述CE4超家族的CDA酶進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該家族的酶在His-His-Asp三連體結(jié)構(gòu)上顯示出高度保守性，并均含有H-D催化活性部位。此外，每個(gè)CDA均含有CE4超家族保守基序motif（1-5）（圖1）。由此可見，今后在進(jìn)行新酶鑒定和分子改造時(shí)可加強(qiáng)對(duì)這些區(qū)域的對(duì)比與研究。

此外，通過使用SWISS-MODEL［29-33］對(duì)CDA1、CDA2、PesCDA、PaCDA進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模，再進(jìn)一步利用PyMOL（www.pymol.org）進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這幾種酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)均有較高的吻合度。通過AnCDA的晶體結(jié)構(gòu)與RcCDA同源建模的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，雖然序列相似性不高，但其結(jié)構(gòu)相似性很高。同時(shí)，這幾種酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析也揭示了這幾種酶均含有該家族所特有的（α/β）8折疊桶結(jié)構(gòu)和6個(gè)loop區(qū)（圖2）。

圖1 蛋白序列同源性及活性位點(diǎn)分析

圖2 CE4超家族脫乙酰酶蛋白同源結(jié)構(gòu)模型

1.2 spore_pdaA 超家族

1.2.1 spore_pdaA 超家族水解底物特性 spore_pdaA超家族是多糖脫乙酰酶中的一個(gè)超家族。該家族的酶主要存在于細(xì)菌孢子壁上，主要作用于N-乙酰肽聚糖和幾丁寡糖。PdaA是枯草芽孢桿菌中的一種脫乙酰酶，該酶與CE4家族的NodB結(jié)構(gòu)域有較高同源性，對(duì)于該酶的報(bào)道多集中于N-乙酰胞壁酸的脫乙酰作用，其最適反應(yīng)pH值為7.0，對(duì)于幾丁質(zhì)的脫乙酰作用較少，但其與CE4家族較高的同源性也使其作為今后CDA潛在研究對(duì)象［34］。

1.2.2 spore_pdaA 超家族結(jié)構(gòu)信息 通過蛋白表面凹陷中的保守殘基推斷該家族蛋白含有一個(gè)與β/α桶狀結(jié)構(gòu)相關(guān)的折疊，與CE4家族相比，其蛋白表面凹陷中特有的Lys和兩個(gè)Arg殘基提供的陽離子也使其能夠更好地結(jié)合聚合度低于3的N-乙酰氨基葡萄糖低聚物。通過已報(bào)道的X-射線觀測(cè)和電子云密度可知GlcNAc與該酶結(jié)合時(shí)會(huì)將一些水分子從活性部位替換出來，同時(shí)根據(jù)蛋白與底物N-乙酰氨基葡萄糖的結(jié)合特點(diǎn)，揭露了其與CE4家族相似的Asp和其它His殘基的催化作用（圖3）［34-35］。

1.3 uraD_N-term-dom 超家族

1.3.1 uraD_N-term-dom 超家族水解底物特性 uraD是一種尿酸鹽分解代謝蛋白，參與尿囊酸鹽分解形成尿囊酸反應(yīng)的最后一步，且通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該類蛋白與幾丁質(zhì)脫乙酰酶家族具有同源性。

通過海洋基因組文庫(kù)篩選出的幾丁質(zhì)脫乙酰酶rCdaYJ［36］，通過生信分析發(fā)現(xiàn)該酶屬于uraD_N-term-dom超家族。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該酶可脫去對(duì)硝基乙酰苯胺上的乙?；鶊F(tuán)，但是目前未發(fā)現(xiàn)該家族酶蛋白能水解幾丁質(zhì)中的乙酰基團(tuán)。

圖3 spore_pdaA超家族蛋白表面氨基酸殘基分析

1.3.2 uraD_N-term-dom 超家族結(jié)構(gòu)信息 通過對(duì)uraD家族puuE蛋白與CE4家族多種酶對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)抑制劑復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)與多糖脫乙酰酶β/α桶狀結(jié)構(gòu)具有總體相似性（圖4），但在低聚物結(jié)合和活性部位幾何結(jié)構(gòu)上存在顯著差異。例如，存在于CE4家族中的His-His-Asp金屬離子結(jié)合結(jié)構(gòu)在puuE中被Glu-His-Trp代替，此外，uraD家族在CE4家族第一個(gè)β/α桶狀結(jié)構(gòu)前多折疊的一個(gè)該結(jié)構(gòu)為其結(jié)合小分子底物提供便利［37］。

圖4 uraD_N-term-dom超家族puuE蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2 最適溫度與pH值

本文中提及的幾丁質(zhì)脫乙酰酶多數(shù)在50℃左右達(dá)到最大酶活。例如，AnCDA、ScCDA2、HcCDA2［38］三者最適溫度均為 50℃。而 SbCODs、VcCOD兩種酶的最適溫度稍低，分別為40℃、45℃。PesCDA、CDA2、CDA1則有較高最適反應(yīng)溫度，分別為55、60和70℃。

此外，對(duì)于pH值而言，多數(shù)酶偏愛弱堿性環(huán)境。如AnCDA、SbCODs、PesCDA、ScCDA2和HcCDA2 5種酶的最適pH值均為8.0。此外，CDA1、CDA2最適pH值分別為7.5、9.0，VcCOD根據(jù)不同體系的緩沖溶液，其pH值在7.0-7.5之間。但是RcCDA卻在偏酸性的環(huán)境中發(fā)揮最大活性，其最適pH值為 5.5-6.0。其中 AnCDA、ScCDA2、HcCDA2三種酶有著相同的最適溫度和pH值。

除了CE4家族的脫乙酰酶外，分別來自spore_pdaA 家族和uraD超家族的PdaA和rCdaYJ的最適pH值分別為7.0和7.4。其中rCdaYJ最適溫度僅為28℃，這可能是因?yàn)閞CdaYJ是海洋基因組文庫(kù)來源的酶，與其所處環(huán)境有關(guān)。

3 金屬離子催化作用

某些情況下金屬離子的催化作用對(duì)于酶發(fā)揮活性具有非常重要的作用，但是不同的酶對(duì)于金屬離子的反應(yīng)不同。較為常見的起促進(jìn)作用的金屬離子是 Co2+， 如 AnCDA、CDA2、ScCDA2、HcCDA2以及毛柄金錢菌（Flammulina velutipes）來源的脫乙酰酶均在Co2+存在的體系中表現(xiàn)為酶活提高，但是VcCOD、CDA1表現(xiàn)出截然相反的現(xiàn)象，Co2+對(duì)這兩個(gè)酶有抑制作用，盡管CDA1與CDA2來源于同一生物體。此外，在有些酶中Mn2+、Mg2+也可起到酶活促進(jìn)作用。而Cu2+、Zn2+則在部分酶中展現(xiàn)出酶活抑制作用。有趣的是，ScCDA2結(jié)構(gòu)上存在鋅離子結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域，但在Co2+離子存在時(shí)展現(xiàn)出最大活力。

4 脫乙酰機(jī)制

目前針對(duì)脫乙酰酶的研究中脫乙酰機(jī)制研究是一個(gè)重點(diǎn)方向，然而就當(dāng)前研究而言，眾多脫乙酰酶在脫乙?；^程中有著不盡相同的脫乙酰產(chǎn)物，且沒有標(biāo)準(zhǔn)的脫乙酰路徑。目前，脫乙酰反應(yīng)中幾乎所有酶唯一一致的方面就是均從非還原末端開始對(duì)幾丁寡糖進(jìn)行脫乙酰反應(yīng)。但對(duì)于水解幾丁二糖，一般生成GlcNAc-GlcN。對(duì)于除單糖、二糖之外的N-乙酰低聚糖，不同的酶會(huì)與糖鏈上不同位置的N-乙?；l(fā)生水解反應(yīng)。如對(duì)于N-乙酰四糖，PesCDA僅能將其水解為AADA（A代表GlcNAc，D代表GlcN），同樣的VcCOD也僅能將N-乙酰四糖脫去單個(gè)乙?；罱K生成ADAA單一產(chǎn)物，而SCCDA2則可通過三步水解反應(yīng)在第一次生成DAAA、ADAA和AADA的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步水解產(chǎn)生 DDAA、DADA和ADDA，最終得到DDDA。

5 總結(jié)與展望

幾丁質(zhì)脫乙酰酶主要來源于真菌和海洋生物，其最適溫度范圍為40-70℃，最適溫度集中在50℃左右，是一類可耐受較高溫度的酶。這類酶的最適pH值集中在8.0附近，最適pH值范圍為5.5-9.0，大多數(shù)酶在堿性條件下活性較高。而Co2+則是最常見的增強(qiáng)酶活的金屬離子，且多數(shù)酶均容易受到金屬離子的影響。在底物識(shí)別方面，幾乎均無法使GlcNAc脫除乙?；?，少數(shù)酶可脫去（GlcNAc）2非還原端的乙酰基團(tuán)，大多數(shù)酶易識(shí)別（GlcNAc）3-6，而α-幾丁質(zhì)和β-幾丁質(zhì)等難溶于水的高聚合度多糖，由于其疏水性導(dǎo)致多數(shù)酶無法對(duì)其產(chǎn)生酶活反應(yīng)，詳見表1。

自然環(huán)境中的微生物資源豐富，蘊(yùn)藏著巨大的基因資源，如Whitman等［39］認(rèn)為土壤、海底淤泥及地表下微生物豐度分別為2.6×1029、3.5×1030及（0.25-2.5）×1030，這些微生物中約有99%是未培養(yǎng)微生物，其中可能包含了很多具有綜合性質(zhì)優(yōu)良的未知酶蛋白。隨著宏基因組學(xué)和基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，目前已有大量的來源于不同自然環(huán)境的宏基因組數(shù)據(jù)可在EBI metagenomics、iMicrobe、IMG/M等公開基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。如利用hmmsearch從CAM_PROJ_GOS單個(gè)宏基因組數(shù)據(jù)集中就可檢索到3423條幾丁質(zhì)脫乙酰酶的基因（E-value值小于0.0001）。這些數(shù)據(jù)也表明了在宏基因數(shù)據(jù)庫(kù)中蘊(yùn)藏了大量的基因資源，而這些基因資源“大數(shù)據(jù)”將是未來幾年分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。

隨著節(jié)能、環(huán)保、高效的工業(yè)生產(chǎn)理念深入人心，高效脫除幾丁質(zhì)中乙酰基團(tuán)的酶制劑必定被市場(chǎng)需求。目前國(guó)內(nèi)外研究中幾丁質(zhì)脫乙酰酶主要來源于真菌，而海洋生物中蝦蟹類生物含有大量幾丁質(zhì)及殼聚糖，因此在海洋基因組文庫(kù)中篩選脫乙酰酶，目的性更強(qiáng)，更具有針對(duì)性。另外該酶目前主要存在對(duì)多糖的脫乙酰度較低，對(duì)于晶體幾丁質(zhì)等疏水性多糖難以發(fā)揮作用等不足之處，故今后應(yīng)加強(qiáng)在脫乙酰酶分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域上進(jìn)行分析改造，并加強(qiáng)構(gòu)建穩(wěn)定高效的工程菌株從而彌補(bǔ)真菌等生物體自身表達(dá)量偏低的缺陷。目前國(guó)內(nèi)外部分機(jī)構(gòu)已檢測(cè)到某些幾丁質(zhì)脫乙酰酶可定點(diǎn)脫去特定位置的乙?；鶊F(tuán)，但這種現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)理卻尚不明確，進(jìn)一步對(duì)幾丁質(zhì)脫乙酰酶水解機(jī)理的研究將有助于定向獲得目的脫乙酰產(chǎn)物。我國(guó)每年有大量的蝦蟹外殼等物質(zhì)被直接廢棄，開發(fā)幾丁質(zhì)脫乙酰酶對(duì)廢棄物二次利用具有極高的價(jià)值，隨著對(duì)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的深入研究，今后必定可通過多種生物原料開發(fā)出高質(zhì)量的殼聚糖副產(chǎn)物。

表1 幾丁質(zhì)脫乙酰酶研究概況