郭萌萌 周延清 段紅英 楊珂 邵露營

（河南師范大學生命科學學院，新鄉(xiāng) 453007）

地黃是我國常用中藥材之一，它是玄參科地黃屬多年生草本植物，地黃根作為藥材，具有顯著的藥用效果，是多種中成藥的成分之一，具有很高的經濟價值［1］。但是，市場上流通的地黃來源雜亂，品質不一，且不同品種間藥用成分差異較大［2］。所以，應采取有效的方法鑒定優(yōu)良種質的地黃品種。

DNA分子標記技術是基因定位克隆，遺傳圖譜構建等研究工作的重要工具，目前已廣泛應用于作物分子輔助育種及種質資源多樣性分析等領域［3-4］，特別是單核苷酸多態(tài)性研究備受關注。單核苷酸SNP是單個核苷酸變異而產生的DNA水平上的多態(tài)性。SNP是大多數基因組中最豐富和穩(wěn)定的遺傳變異形式，多態(tài)性高，數量多，已成為植物分子輔助育種的主要分子標記之一［5］。

基于轉錄組測序能夠大規(guī)模的挖掘SNP位點。在植物中的應用也十分廣泛，候莉娟等［6］在實驗室已有轉錄組數據的基礎上，挖掘了大量羊草的SNP對羊草種質進行分型；周軍永等［7］以李府貢棗不同處理棗果實的轉錄組序列為基礎，分析了轉錄組數據中SNP位點的分布，為棗的遺傳結構和遺傳分化奠定了基礎。Wu等［8］基于銀杏轉錄組測序收集并驗證SNP位點，并分析群體遺傳多樣性，為銀杏的遺傳和基因組研究提供了有用資源。

目前，利用SNP分子標記技術探討地黃種屬親緣關系及品種鑒定的研究很少，本研究利用RNA-seq 技術，對85-5地黃新鮮塊根進行轉錄組測序，根據測序數據與NCBI中SRA數據庫中的3個地黃數據比對，利用Samtools（http：//samtools.sourceforge.net/） 和 VarScan v.2.2.7（http：//varscan.sourceforge.net/）軟件尋找候選SNP。針對候選SNP位點設計引物，選擇能夠擴增出單一目的條帶的引物，對地黃28個品種間擴增，旨為地黃遺傳多樣性分析和品種鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用地黃種質收集于河南 4 個市縣、山東 2 個區(qū)縣和上海華東師范大學，包括裂葉地黃（Rehmannia piasezkii）和地黃（Rehmannia glutinosa）這2個種，共 28 份種質。均經過ITS測序與NCBI比對，確定為裂葉地黃或地黃種質［9］（表1）。

實驗用 Taq Master Mix 由北京康為世紀生物科技有限公司合成，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、快速簡便、特異性強等優(yōu)點。

SNP引物Primer軟件設計后于英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

表1 地黃樣本信息

1.2 方法

1.2.1 挖掘SNP位點 根據實驗室前期得到的地黃轉錄組數據，將其與在NCBI數據庫上下載的3個轉錄組數據庫，下載的轉錄組數據測序數據分別是由河南農業(yè)大學上傳的SRR444423.sra 數據量為485 M；河南農業(yè)大學上傳SRR832972.sra 數據量2.1 G；藥用植物研究所上傳的SRR832973.sra數據量2.1 G。然后通過格式轉換之后，以這3個組裝好的轉錄本為模板序列，將原始序列與其進行比對，利 用 Samtools（http：//samtools.sourceforge.net/） 和VarScan v.2.2.7（http：//varscan.sourceforge.net/） 軟件尋找候選SNP。

1.2.2 設計SNP引物 根據挖掘到的候選SNP位點，利用Primer軟件設計引物。在SNP位點的上下游分別設計正向引物和反向引物，理想引物的長度為18-24 bp，Tm值為50-60℃，能保證上下游引物的Tm值一般不超過2℃；引物序列的GC 含量一般為40%-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應，上下游引物的GC含量不能相差太大。

1.2.3 篩選SNP引物 通過PCR來驗證SNP引物。設計的SNP引物，需要確保能擴增出單一、明亮的條帶。PCR擴增反應體系為20 μL，包含6 μL的dd H2O，1 μL 的模板 DNA，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，10 μL Mix。擴增程序：94℃預變性3 min；94℃變性30s，適宜退火溫度退火30s，72℃延伸30s，34個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，膠回收后測序。

1.2.4 SNP位點用于28種地黃分型 分別以28種地黃基因組DNA為模板，選用初篩的引物來對其進行PCR擴增，回收目的片段，Sanger法正反向測序目的序列，檢測SNP位點多態(tài)性。根據SNP位點繪制指紋圖譜。

2 結果

2.1 地黃SNP位點的挖掘

在地黃轉錄組中共有 102075條 Unigene中，檢測到 35339 個 SNP 位點，在轉錄組數據中的發(fā)生頻率為0.51/kb。檢測出的SNP位點中發(fā)生轉換共22718個（64.28%），顛換共12621個（35.72%），這6種單核苷酸變異里C/T和A/G的頻率最高，分別達到31.95%和32.33%，其他4種單核苷酸變異中A/T、A/C、T/G、C/G的頻率分別為9.22%、9.36%、8.80%和8.34%。本次研究極大豐富了地黃的SNP位點信息（表2）。

2.2 SNP引物的設計與篩選

根據SNP挖掘結果，用Primer 5設計了39對引物，包含了54個候選SNP位點。對設計的39對SNP引物，以地黃85-5基因組為模板進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，從中挑選出了28對符合預期產物長度、擴增效果清晰單一的SNP引物對（圖1），用以進行后續(xù)分型實驗。

表2 地黃轉錄組SNP位點統(tǒng)計結果表

圖1 引物特異性篩選部分結果

2.3 地黃SNP標記的開發(fā)

為開發(fā)多態(tài)性地黃SNP引物，我們用2.2實驗篩選出的28對特異性引物對28種地黃種質進行分型實驗（圖2）。經過PCR擴增目的片段，切膠純化回收后用Sanger法直接測序。在28對引物擴增的PCR產物中，能夠直接測序成功并且SNP位點在不同地黃種質間不同的僅有7對（表3）。經過DNAMAN序列比對軟件比對后，可以直觀的看出不同地黃種質間的SNP位點變化，位點SNP1的比對圖如圖2所示。經測序后統(tǒng)計7對引物所包含的8個SNP位點在28種地黃種質間的檢測結果，如表4所示。

2.4 基于SNP位點指紋圖譜繪制

通過對28份地黃的8個SNP位點的分析，發(fā)現(xiàn)可以將地黃17個種質區(qū)分開。利用這8個SNP位點繪制17份地黃種質的指紋圖譜，如圖3所示，不同引物對的分型結果用不同的顏色區(qū)分；同一引物對的分型結果用數據條長短區(qū)分，數據條長度相同的種質，基因型一致，數據條長度不同的種質，表明在基因分型時被分到不同的組。如DH2和DH3兩份地黃種質僅在SNP3位點存在差異，其余的SNP位點均無差異，這表明兩份種質的差異較?。欢鳧H6和DH17則是除了在SNP7變異位點處相同，其余的6個SNP位點均存在差異，表明它們差異較大。

圖2 引物S10在28份地黃材料中擴增電泳圖

表37對多態(tài)性SNP引物

3 討論

目前，應用于地黃的分子標記主要有RAPD、ISSR［10］、ITS［9］、SSR［11-12］和 SCoT［1］等。但這些分子標記各有不足［13］，如技術難度高，實驗重復性差，對PCR體系要求高等，限制了這些技術的發(fā)展與應用。SNP分子標記是一種特異性強的遺傳標記，隨著高通量測序技術的廣泛應用，以及SNP標記的檢測成本的逐漸下降，基于轉錄組測序來挖掘SNP位點，會使得SNP分子標記技術越來越高效。對于多倍體或沒有參考基因組的物種來說，利用新一代高通量轉錄組測序技術可大量鑒定SNP［6］。近年也被成功地應用于植物的基因分型、品種鑒定、新品種選育等研究中，Jiang［14］利用開發(fā)的14個SNP標記對30個柑橘品種進行基因分型，區(qū)分了品種間的親緣關系；李志遠等［15］在甘藍中篩選出50個核心SNP標記用于構建59個甘藍品種的指紋圖譜，能有效鑒定品種的特異性和真實性；Distefano 等［16］開發(fā)出了21個柑橘SNP標記，并對18個柑橘品種進行遺傳多樣性分析；吳澎等［17］在小麥中可利用SNP標記技術和基因工程技術相結合，將多個優(yōu)質感官性狀基因聚合到一個小麥新品種上；Ferguson等［18］利用53個木薯品種對候選SNP位點的驗證，篩選出1190個穩(wěn)定且具有多態(tài)性的SNP標記，用于對木薯的多樣性評估和地理起源分析。

目前，常用于SNP分析的有等位基因特異性PCR法［19］、高分辨率溶解曲線分析［20］、DNA芯片法［21］和直接測序分型法等。由于AS-PCR法對PCR體系要求嚴格，HRMA法需要使用專門的設備，DNA芯片法需要大量合成特異性探針，都不是最優(yōu)的SNP分型法?；赟anger測序法的SNP分型，它的測序準確度高，不僅能夠發(fā)現(xiàn)和檢測不同個體間存在的所有堿基變異，同時還可以明確各個的位置及變異類型，是實驗室常用的SNP分型方法。

表428份地黃材料在8個SNP位點的堿基信息

但是，到目前為止，還未見使用SNP分子標記對地黃種質進行研究。SNP分子標記因其在基因組中數量最多、分布最廣及具有雙等位基因等特性，正好可以打破地黃品種的遺傳基礎狹窄，品種間遺傳分化不明顯［22］這種局限性，SNP標記將在新品種的特異性、真實性鑒定方面有更多應用。為此，本研究利用首次使用SNP分子標記分析28種地黃的遺傳多樣性，豐富地黃分子標記技術，為區(qū)分地黃種質提供有力的分子標記技術。

本研究通過轉錄組挖掘SNP位點，豐富了地黃基因組SNP變異信息，在Unihene中共發(fā)現(xiàn)3339個SNP位點，其中轉換類型發(fā)生頻率顯著高于顛換類型，轉換發(fā)生頻率約為顛換的兩倍，這與其他植物轉錄組SNP變異類型的比例相似［23-24］。轉換類型中A/G（32.33%）和C/T（31.95%）的發(fā)生頻率最高，顛換類型中A/T最高為9.22%。地黃轉錄組中SNP位點非常豐富，可為地黃遺傳多樣性分析、親緣關系鑒定與品種區(qū)分等方面提供豐富的基礎數據信息。根據SNP候選位點設計的39對引物中，以地黃85-5基因組為模板進行PCR擴增，篩選出28對擴增條帶單一、產物長度符合預期的引物，引物特異性篩選率為72%，成功率較高。但是篩選出的候選SNP位點驗證成功率并不是很高，僅有7對引物所包含的8個SNP位點在28種地黃種質中有差異。這可能是由于在轉錄組挖掘SNP位點時，對原始測序數據分析時造成的SNP位點的假陽性的原因［25-26］。使用28對引物在28種地黃中進行分型實驗，結果僅有7對引物所包含的8個SNP位點表現(xiàn)出多態(tài)性，根據8個SNP位點構建紋圖譜，可以直觀的區(qū)分17種地黃種質。根據指紋圖譜可以看出8個SNP位點可以將裂葉地黃從其余27種地黃種質中區(qū)分出來，表明篩選出SNP位點可以用于地黃的種間區(qū)分。其余的鑒別出來的16種地黃種質都屬于地黃種，表明8個SNP位點也可用于地黃的種間區(qū)分。

在地黃其他分子標記的研究中，張進忠等［27］篩選出的17條RAPD引物在10個地黃品種都可以擴增出各自的多態(tài)性條帶，檢測10個地黃品種的種質遺傳多樣性；周延清［10］篩選出17條RAPD引物和10條ISSR引物用于對10個地黃品種的種質遺傳多樣性分析，并且篩選出能夠鑒別10個地黃樣品的RAPD引物兩個與ISSR引物一個；郭冠瑛［2］利用地黃轉錄組信息，設計了 320 對 EST-SSR引物，213對引物在地黃85-5的基因組擴增出了產物，只有 80對引物在 36 份地黃種質中具有多態(tài)性。楊珂等［1］利用5個SCoT引物構建30份地黃種質的指紋圖譜，結果能區(qū)分開7個地黃常見栽培品種。我們基于8個SNP位點繪制指紋圖譜，可以將28個地黃種質區(qū)分出17種，區(qū)分力度稍弱，這有待于繼續(xù)大量開發(fā)SNP位點，為地黃品種鑒定提供更有效的技術。

本研究以鑒定地黃品種，豐富地黃分子標記為目的，采用PCR產物直接測序的方法進行地黃的SNP分型，結果表明有7對引物，包含8個SNP位點能在17份地黃材料中表現(xiàn)出多態(tài)性，并根據8個SNP位點的差異構建了指紋圖譜，對地黃品種的遺傳多樣性做了補充，為鑒定地黃品種開發(fā)了有效的分子標記，為大量開發(fā)地黃SNP標記來全面評估地黃遺傳多樣性奠定基礎，使用SNP分子標記技術來準確鑒定地黃品種對種質管理和育種也有重要意義。

圖3 利用8個SNP位點對地黃17個種質繪制的指紋圖譜

4 結論

通過地黃轉錄組挖掘SNP位點，在28份地黃種質中篩序多態(tài)性SNP位點，利用8的SNP位點能夠鑒定17種不同的地黃種質。