吳 彤 汪曉強(qiáng) 張芮芮 蘇殿三 俞衛(wèi)鋒 田 婕

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是一種常見(jiàn)的麻醉手術(shù)相關(guān)的并發(fā)癥，可發(fā)生于14%～24%的非心臟手術(shù)患者，其特點(diǎn)是患者手術(shù)后認(rèn)知學(xué)習(xí)行為能力受損，對(duì)外界信息的處理能力降低［1-2］，可嚴(yán)重影響患者的術(shù)后生活質(zhì)量，甚至發(fā)展為不可逆的認(rèn)知障礙［3］。關(guān)于POCD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前最為廣泛接受的假說(shuō)是中樞炎性反應(yīng)是POCD的關(guān)鍵致病原因［4-6］。目前，全球由腫瘤所致的負(fù)擔(dān)逐年加重，隨著臨床診斷技術(shù)的發(fā)展、外科手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步和治療手段的不斷革新，約80%的腫瘤患者需要手術(shù)干預(yù)［7-8］。隨著人口老齡化的發(fā)展，腫瘤患者的術(shù)后精神健康狀態(tài)不僅是一個(gè)重要的臨床議題，毫無(wú)疑問(wèn)也將成為一個(gè)不可忽視的社會(huì)問(wèn)題［9-10］。值得注意的是，腫瘤與炎性反應(yīng)的關(guān)系十分復(fù)雜。一方面，慢性炎性反應(yīng)在腫瘤的發(fā)生中扮演著重要角色，至少25%的腫瘤發(fā)生與慢性炎性反應(yīng)相關(guān)［11-12］；另一方面，各種各樣的炎性細(xì)胞，包括先天性免疫和獲得性免疫細(xì)胞，都可以被腫瘤細(xì)胞激活［13-14］。在機(jī)體識(shí)別到腫瘤細(xì)胞的存在時(shí)，絕大多數(shù)炎性細(xì)胞都會(huì)擴(kuò)增、分泌炎性細(xì)胞因子或在腫瘤微環(huán)境中與其他細(xì)胞產(chǎn)生交互作用而影響腫瘤的進(jìn)程［13-16］。由激活免疫系統(tǒng)引起的神經(jīng)炎癥的瀑布反應(yīng)是認(rèn)知損傷的關(guān)鍵因素，因此推測(cè)擁有特殊炎癥環(huán)境的荷瘤個(gè)體在受到手術(shù)應(yīng)激時(shí)會(huì)表現(xiàn)出與正常個(gè)體不同的免疫防御特點(diǎn)和神經(jīng)炎癥應(yīng)答，因而其術(shù)后認(rèn)知功能與正常個(gè)體可能也有所不同。本研究通過(guò)結(jié)合小鼠皮下荷瘤模型與骨科手術(shù)，探討荷瘤狀態(tài)對(duì)小鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的構(gòu)建和分組 本研究的倫理審查證明由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理中心提供（RJ-2017-10-10）。2月齡雄性C57BL／6J小鼠由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，體重23～25 g。將小鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)化籠盒內(nèi)自由飲食，維持溫度為（22±2）℃，環(huán)境為每12 h日夜交替。小鼠適應(yīng)新的環(huán)境至少長(zhǎng)于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前的7 d。根據(jù)荷瘤和手術(shù)情況，將小鼠隨機(jī)分入對(duì)照組、手術(shù)組、腫瘤組和腫瘤加手術(shù)組。

1.2 腫瘤接種模型建立 腫瘤組和腫瘤加手術(shù)組小鼠于右背側(cè)腋窩皮下組織內(nèi)接種小鼠來(lái)源的結(jié)腸癌細(xì)胞系 MC38細(xì)胞懸液（100μL），接種細(xì)胞數(shù)量為2×105／只。隨后，小鼠被放回各自的籠盒中，接種后第7天起，每2～3 d檢查一次小鼠的基本狀況。3周后，待腫瘤長(zhǎng)徑為0.8～1.0 cm，行脛骨骨折內(nèi)固定手術(shù)。

1.3 脛骨骨折內(nèi)固定術(shù) 手術(shù)組和腫瘤加手術(shù)組小鼠在氟哌利多（200μg／kg）和芬太尼（10 mg／kg）復(fù)合麻醉下行脛骨骨折內(nèi)固定手術(shù)。切皮前于皮下注射布托啡諾（0.4 mg／kg）鎮(zhèn)痛。左后側(cè)脛前皮膚備皮、消毒、鋪巾，于左后側(cè)脛前皮膚沿中線做一長(zhǎng)約1 cm的縱形切口，分離并暴露小鼠脛骨，分離骨膜。將一根長(zhǎng)約8 mm、直徑0.38 mm的針置入骨髓腔內(nèi)，切斷脛骨。術(shù)畢，用0.9%氯化鈉溶液清理傷口，縫合切口，將小鼠放回干凈的籠盒內(nèi)，保溫，等待麻醉蘇醒。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 每組取7或8只小鼠，采用用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠的參考記憶（reference memory）。在水迷宮開(kāi)始前，每天撫觸小鼠約2 min，持續(xù)3 d，讓小鼠熟悉實(shí)驗(yàn)者的氣味，以減少應(yīng)激反應(yīng)。在脛骨骨折手術(shù)后第3天開(kāi)始水迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)持續(xù)5 d，分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)4 d，每天訓(xùn)練4次，每輪間隔30～40 min，將平臺(tái)置于第2象限（靶象限）中間位置，距水面1～2 cm，訓(xùn)練過(guò)程中平臺(tái)位置保持不變，每天隨機(jī)選取除靶象限外的其他3個(gè)象限的任意4個(gè)定點(diǎn)投放小鼠。小鼠入水后可自由尋找平臺(tái)，若在1 min內(nèi)成功找到平臺(tái)，該輪訓(xùn)練終止，并使小鼠在平臺(tái)上停留20 s；若小鼠不能在1 min內(nèi)成功找到平臺(tái)，可將其輕輕引導(dǎo)至平臺(tái)并使其在平臺(tái)上停留20 s，記錄小鼠游泳的軌跡、運(yùn)動(dòng)速度和找到水下平臺(tái)所用時(shí)間（逃避潛伏期）。水迷宮實(shí)驗(yàn)第5天，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠對(duì)空間位置的記憶能力。撤掉平臺(tái)，分別在目標(biāo)象限和相反象限入水點(diǎn)將小鼠投入池內(nèi)，記錄小鼠60 s內(nèi)各象限時(shí)間分布和游泳速度等參數(shù)，兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。具體方法參照參考文獻(xiàn)［17］。

1.5 Western印跡法檢測(cè)小鼠海馬組織內(nèi)可溶性淀粉樣前體蛋白（s APP）α和IL-6蛋白質(zhì)表達(dá)分別于脛骨骨折內(nèi)固定術(shù)后第7天和術(shù)后48 h處死小鼠并分離其海馬組織，提取蛋白質(zhì)，檢測(cè)s APPα和IL-6蛋白質(zhì)表達(dá)。采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量（美國(guó)Thermo Fisher公司）法定量蛋白質(zhì)濃度，以總蛋白質(zhì)量25μg／孔進(jìn)行8%SDS-PAGE變性電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。以3%胎牛血清白蛋白（BSA）于室溫封閉1 h。所用一抗分別為小鼠抗小鼠s APPα抗體（1∶1 000，德國(guó)IBL公司），兔抗小鼠IL-6抗體（1∶1 000，美國(guó)CST公司），二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（比例均為1∶1 000，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），以β-actin為內(nèi)參照。顯色條帶后，應(yīng)用Image Lab圖像分析軟件分析處理?xiàng)l帶。

1.6 RT-PCR檢測(cè)小鼠海馬組織內(nèi)IL-6 mRNA表達(dá) 每組另取8只小鼠，術(shù)后48 h取1葉海馬組織放入TRIzol（美國(guó)Sigma公司）中提取RNA。然后將RNA樣本溶解于DEPC溶液中，應(yīng)用Nano drop分光光度計(jì)檢測(cè)提取的mRNA濃度。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Ta KaRa公司）將m RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，將熒光染料SYBR Green與cDNA配成10μL反應(yīng)體系，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。IL-6上游引物為5’-TAG TCC TTC CTA CCC CAA TTT CC-3’，下 游 引 物 為 5’-TTG GTC CTT AGC CAC TCC TTC-3’；GAPDH 上游引物為5’-AAG AAG GTG GTG AAG CAG GCA TC-3’，下游引物為5’-CGG CAT CGA AGG TGG AAG AGT G-3’。

1.7 ELISA檢測(cè)小鼠外周血血漿中IL-6含量每組另取的8只小鼠術(shù)后48 h取海馬組織的同時(shí)取其外周血。離心分離血漿后，參照IL-6 ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。所有步驟完成后，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450和570 nm吸光度A值，用A570值矯正檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本IL-6含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Prism 7統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以x-±s表示，采用連續(xù)測(cè)量的方差分析比較小鼠Morris水迷宮平均游泳速度和小鼠逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)的變化情況；采用單因素方差分析比較各組小鼠測(cè)試階段的穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限游泳時(shí)間、海馬組織中IL-6和s APPα蛋白質(zhì)表達(dá)水平、IL-6 m RNA表達(dá)水平，以及血漿IL-6含量。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 MC38腫瘤細(xì)胞接種2周后，小鼠皮下可觸及瘤體組織。再1周后，腫瘤長(zhǎng)徑達(dá)到0.8～1.0 cm，對(duì)小鼠左后肢行脛骨骨折內(nèi)固定術(shù)。與對(duì)照組小鼠相比，腫瘤組和腫瘤加手術(shù)組小鼠進(jìn)食飲水和自主行為無(wú)明顯異常，皮毛有光澤。

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 各組小鼠間游泳速度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）；水迷宮實(shí)驗(yàn)第3和4天定位航行實(shí)驗(yàn)階段，腫瘤加手術(shù)組小鼠的逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于對(duì)照組同時(shí)間（P值分別＜0.05、0.01），而手術(shù)組和腫瘤組與對(duì)照組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05），見(jiàn)表1。水迷宮實(shí)驗(yàn)第5天空間探索實(shí)驗(yàn)階段，撤掉水下平臺(tái)后，腫瘤加手術(shù)組小鼠在目標(biāo)象限游泳時(shí)間顯著短于對(duì)照組（P＜0.05），穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)顯著少于對(duì)照組（P＜0.01），而手術(shù)組和腫瘤組與對(duì)照組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05），見(jiàn)表2。

2.3 術(shù)后小鼠海馬組織內(nèi)s APPα表達(dá) 對(duì)照組、手術(shù)組、腫瘤組和腫瘤加手術(shù)組小鼠海馬組織內(nèi)sAPPα的相對(duì)蛋白質(zhì)含量分別為0.28±0.05、0.23±0.05、0.24±0.09、0.16±0.03，腫瘤加手術(shù)組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），而手術(shù)組和腫瘤組與對(duì)照組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05），見(jiàn)圖1。（x-±s）

表1 4組小鼠Morris水迷宮游泳速度和逃避潛伏期比較

表2 4組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)象限游泳時(shí)間和穿越平臺(tái)所在位置次數(shù)比較（x-±s）

圖1 Western印跡法檢測(cè)各組小鼠海馬組織內(nèi)s APPα蛋白質(zhì)的表達(dá)

2.4 術(shù)后小鼠海馬組織內(nèi)IL-6蛋白質(zhì)和IL-6 mRNA表達(dá) 對(duì)照組、手術(shù)組、腫瘤組和腫瘤加手術(shù)組小鼠海馬組織內(nèi)IL-6蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量分別為1.04±0.12、1.35±0.21、1.17±0.17、1.94±0.62，腫瘤加手術(shù)組顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），而手術(shù)組和腫瘤組與對(duì)照組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05），見(jiàn)圖2。對(duì)照組、手術(shù)組、腫瘤組和腫瘤加手術(shù)組小鼠海馬組織內(nèi)IL-6 m RNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.07±0.41、1.25±0.31、1.25±0.33、1.12±0.43，各組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）。

圖2 Western印跡法檢測(cè)各組小鼠海馬組織內(nèi)IL-6蛋白質(zhì)表達(dá)

2.5 術(shù)后小鼠外周血血漿內(nèi)IL-6水平 術(shù)后48 h對(duì)照組、手術(shù)組、腫瘤組和腫瘤加手術(shù)組小鼠血漿IL-6水平分別為（0.97±0.26）、（3.47±1.27）、（4.56±2.34）、（9.16±6.65）ng／L，腫瘤加手術(shù)組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而手術(shù)組和腫瘤組與對(duì)照組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）。

3 討 論

本研究通過(guò)建立成年小鼠皮下荷瘤和脛骨骨折內(nèi)固定手術(shù)模型，檢測(cè)荷瘤狀態(tài)對(duì)小鼠POCD的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，脛骨骨折內(nèi)固定手術(shù)不影響普通成年小鼠術(shù)后空間參考記憶，但會(huì)引起成年荷瘤小鼠該種記憶的損傷，伴隨腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)分子s APPα表達(dá)降低，以及術(shù)后48 h外周血血漿和海馬組織中促炎細(xì)胞因子IL-6表達(dá)水平升高，但是海馬組織中IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化。大量文獻(xiàn)提示，中樞高水平IL-6與機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力降低密切相關(guān)，本研究結(jié)果提示，荷瘤小鼠更容易發(fā)生POCD可能與其手術(shù)后海馬組織中高表達(dá)IL-6有關(guān)，而IL-6更可能來(lái)源于外周而非中樞本身。

本研究應(yīng)用Morris水迷宮檢測(cè)小鼠能否對(duì)水下平臺(tái)的空間位置形成準(zhǔn)確記憶。在定位航行實(shí)驗(yàn)階段，各組小鼠的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)的增加逐漸縮短，表明各組小鼠逐漸對(duì)水下平臺(tái)位置形成記憶?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，腫瘤加手術(shù)組小鼠在目標(biāo)象限的平均游泳時(shí)間顯著短于對(duì)照組，穿過(guò)原水下平臺(tái)位置的次數(shù)顯著少于對(duì)照組，表明該組小鼠的記憶能力顯著低于對(duì)照組小鼠。這一現(xiàn)象未在手術(shù)組小鼠中出現(xiàn)，提示與普通小鼠相比，荷瘤小鼠更容易在術(shù)后出現(xiàn)認(rèn)知功能損傷?？臻g參考記憶代表了小鼠對(duì)水下平臺(tái)的長(zhǎng)時(shí)記憶能力，其管理中樞主要位于海馬組織，因此之后本研究檢測(cè)了海馬組織中s APPα表達(dá)。s APPα是淀粉樣前體蛋白（APP）在內(nèi)切酶的作用下生成的子片段，與同樣是在APP剪切后形成的Aβ不同，s APPα具有較為公認(rèn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用，可增加突觸密度，促進(jìn)已有的記憶鞏固，防止毒性物質(zhì)對(duì)神經(jīng)突觸的損傷［18-19］。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后荷瘤小鼠海馬組織內(nèi)s APPα的相對(duì)蛋白質(zhì)含量顯著低于對(duì)照組，證明手術(shù)可引起荷瘤小鼠海馬組織內(nèi)具有神經(jīng)保護(hù)作用的分子表達(dá)降低，使得腫瘤加手術(shù)組小鼠自身的神經(jīng)保護(hù)作用低于一般小鼠。

既往研究［4-5，20］結(jié)果提示，外周手術(shù)可引起成年個(gè)體發(fā)生一過(guò)性中樞炎性反應(yīng)。術(shù)后12 h海馬區(qū)IL-6水平升至峰值［4，21］，術(shù)后48 h降至基礎(chǔ)水平［22］，這種一過(guò)性中樞炎性反應(yīng)不會(huì)損傷成年小鼠的空間參考記憶［20］。本研究結(jié)果也顯示，普通成年小鼠海馬組織內(nèi)IL-6蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量在術(shù)后48 h基本回歸基礎(chǔ)水平，而荷瘤小鼠海馬組織內(nèi)的IL-6表達(dá)仍保持在較高水平。由于廣泛而長(zhǎng)時(shí)的中樞炎性細(xì)胞因子暴露是導(dǎo)致認(rèn)知紊亂的關(guān)鍵因素［21-23］，因而術(shù)后荷瘤小鼠海馬組織內(nèi)的IL-6持續(xù)高表達(dá)為荷瘤小鼠更容易發(fā)生POCD提供了合理的解釋。有趣的是，在MC38腫瘤模型中，荷瘤小鼠術(shù)后48 h海馬組織內(nèi)IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量在各組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在血漿中IL-6水平的升高趨勢(shì)與海馬組織中IL-6蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量的升高趨勢(shì)保持一致，據(jù)此推測(cè)，術(shù)后48 h荷瘤小鼠海馬組織內(nèi)升高的IL-6更可能來(lái)源于外周循環(huán)中活化的炎性細(xì)胞，而不是海馬組織本身。荷瘤小鼠手術(shù)后外周循環(huán)中炎性細(xì)胞因子長(zhǎng)時(shí)間高表達(dá)的原因尚不清楚，推測(cè)可能與荷瘤個(gè)體中的腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞在手術(shù)后活化有關(guān)，尚需要更多的研究加以證實(shí)。

本研究存在一定局限性。盡管本研究結(jié)果初步顯示持續(xù)的荷瘤狀態(tài)可易化POCD發(fā)生，且這一現(xiàn)象可能與荷瘤小鼠手術(shù)后體循環(huán)中高表達(dá)的IL-6有關(guān)，但并未對(duì)IL-6進(jìn)行干預(yù)以證實(shí)其與POCD的真正相關(guān)性，也未能找到其準(zhǔn)確的細(xì)胞來(lái)源，有待今后就上述問(wèn)題進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證明了與普通小鼠相比，荷瘤小鼠更容易發(fā)生POCD，伴隨海馬組織中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)分子s APPα表達(dá)降低，其原因可能與荷瘤狀態(tài)加重手術(shù)導(dǎo)致的外周免疫反應(yīng)和促進(jìn)中樞炎性反應(yīng)有關(guān)。對(duì)該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究將促進(jìn)對(duì)POCD的理解，并有助于改善腫瘤患者的術(shù)后精神狀態(tài)。