周雨曦 聞大翔 俞衛(wèi)鋒 杭燕南

急性缺血性腦卒中為最常見的腦卒中類型，且溶栓治療窗短，因此患者極易發(fā)生遠(yuǎn)期神經(jīng)功能障礙，如肌力降低、認(rèn)知障礙等問題。當(dāng)腦血管急性堵塞時，中心區(qū)域?yàn)橥耆Ｋ绤^(qū)，而周邊腦組織發(fā)生急性炎性反應(yīng)，若未得到及時有效的治療，會發(fā)生壞死加重?fù)p傷?？寡字委熆舍槍Ｋ绤^(qū)周邊腦組織產(chǎn)生保護(hù)作用，是重要的治療方法［1］。研究［2-3］結(jié)果表明，缺血性腦卒中患者血清IL-6水平升高，且IL-6水平與患者的腦梗死體積、不良預(yù)后呈正相關(guān)。本研究旨在探討IL-6中和抗體處理對缺血性腦卒中小鼠的腦梗死體積、腦組織急性炎性反應(yīng)和腦梗死長期預(yù)后（腦梗死后28 d）的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和材料 健康成年雄性C57小鼠（清潔級）60只，平均體重為（30±5）g，由原第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供。吸入麻醉藥七氟烷為上海恒瑞醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品，IL-6中和抗體（MP5-20F3）和IgG同源對照抗體均為美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司產(chǎn)品，CD3兔抗小鼠中和抗體為艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司產(chǎn)品，Iba-1兔抗小鼠中和抗體為日本和光純藥工業(yè)株式會社產(chǎn)品。小動物麻醉機(jī)為美國肯特科技公司產(chǎn)品，冰凍切片機(jī)為美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司產(chǎn)品，熒光顯微鏡為德國卡爾·蔡司股份公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)小鼠的飼養(yǎng)和分組 將60只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、IL-6中和抗體處理組和IgG對照組，每組20只。小鼠手術(shù)前后均于實(shí)驗(yàn)室動物房內(nèi)飼養(yǎng)，自由飲食，室溫維持20～22℃，每12 h日夜交替。

1.3 小鼠腦缺血模型制作和分組處理 用體積分?jǐn)?shù)為0.02的七氟烷、0.30的氧氣和0.68的一氧化二氮混合氣體麻醉小鼠，用小動物麻醉機(jī)控制呼吸，溫控加熱板將小鼠術(shù)中直腸溫度維持于（37.0±0.5）℃。IL-6中和抗體處理組和IgG對照組小鼠行大腦中動脈遠(yuǎn)端栓塞術(shù)，取頸部正中切口，分離迷走神經(jīng)，結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，縫合頸部切口；在小鼠左眼與左耳之間切開皮膚約1 cm，使用雙極電凝器游離顳肌，用顱鉆切開顱骨暴露大腦中動脈；隨后移除腦膜，使用雙極電凝器凝斷遠(yuǎn)端大腦中動脈及其分支。假手術(shù)組小鼠采用同樣的麻醉和手術(shù)方法，但不阻斷頸總動脈和大腦中動脈［4］。術(shù)后2 h，IL-6中和抗體處理組小鼠于腹腔內(nèi)注射IL-6中和抗體600μg／kg，IgG對照組小鼠于腹腔內(nèi)注射IgG同源對照抗體600μg／kg。

1.4 計(jì)算腦梗死體積 每組取6只小鼠，在術(shù)后3 d斷頭取腦，去除嗅球和腦干部分，置于冠狀腦模具中連續(xù)切成1 mm腦片，共7片。將切片置于2%氯化三苯四氮唑（TTC）溶液中孵育30 min，4%多聚甲醛溶液固定，無法被TTC染色的白色區(qū)域?yàn)槿毖Ｋ绤^(qū)。應(yīng)用Image J軟件計(jì)算梗死面積，梗死體積=梗死面積×腦片厚度（1 mm）。校正腦水腫后的實(shí)際腦梗死體積=梗死對側(cè)半球體積-梗死同側(cè)非梗死區(qū)域體積。

1.5 免疫熒光染色和熒光顯微鏡觀察 每組取4只小鼠，在術(shù)后3 d用2%戊巴比妥麻醉，經(jīng)左心室快速灌注0.9%氯化鈉溶液40 m L后，繼續(xù)灌注4%多聚甲醛溶液40 m L。目前已知，腦組織中固有的小膠質(zhì)細(xì)胞和外周浸潤的T淋巴細(xì)胞是受損腦組織炎性細(xì)胞因子的主要來源。采用CD3抗體標(biāo)記T淋巴細(xì)胞，Iba-1抗體標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞。取腦組織依次置于20%蔗糖溶液和30%蔗糖溶液中至腦組織沉底，1 d后行冰凍切片，厚度為25μm。以5%牛血清白蛋白室溫封閉腦片1 h，加入CD3抗體（1∶200）、Iba-1抗體（1∶1 000），于4℃孵育過夜，室溫漂洗后加入驢抗兔紅色熒光二抗稀釋液（1∶1 000），再室溫孵育2 h，漂洗后貼片、晾干后4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片。于熒光顯微鏡下觀察并拍攝有效圖像，計(jì)數(shù)腦梗死周邊區(qū)域陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 行為學(xué)評估

1.6.1 神經(jīng)功能評分 每組各取10只小鼠，分別于腦卒中術(shù)前和術(shù)后3、5、7、14、21、28 d，采用改良Garcia評分從肢體感覺、爬行能力、轉(zhuǎn)向能力、肢體對稱性和前肢運(yùn)動能力5個方面進(jìn)行評分，每項(xiàng)0～3分，神經(jīng)功能總評分15分，得分越低提示神經(jīng)損傷越嚴(yán)重［5］。

1.6.2 感覺運(yùn)動功能測試 每組取進(jìn)行神經(jīng)功能評分的10只小鼠行黏紙實(shí)驗(yàn)，均以相同的壓力在小鼠的損傷側(cè)前爪粘貼大小為0.3 cm×0.4 cm的黏紙，隨后將小鼠放于透明觀察盒中，記錄小鼠感知和撕除黏紙的時間，最長時限為120 s。缺血性腦卒中后，小鼠感覺運(yùn)動功能受損，感知并撕除黏紙所需時間延長，時間越長提示感覺運(yùn)動功能受損越嚴(yán)重。小鼠術(shù)前連續(xù)3 d每天訓(xùn)練1次，記錄基礎(chǔ)值，測試當(dāng)日測試1次，記錄每周3個測試日數(shù)據(jù)的平均值作為該周感覺運(yùn)動功能的評估指標(biāo)［6］。在造模后第3～5天（第1周）、第10～12天（第2周）、第17～19天（第3周）、第24～26天（第4周）對小鼠進(jìn)行感覺運(yùn)動功能測試，計(jì)算術(shù)后第1～4周感覺運(yùn)動功能的評估指標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以x-±s表示，呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)表示。組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦梗死體積比較 術(shù)后3 d，假手術(shù)組、IL-6中和抗體處理組和IgG對照組的腦梗死體積分別為0.45（0，1.05）、（14.9±2.2）和 （18.0±1.4）mm3，IL-6中和抗體處理組和IgG對照組均顯著大于假手術(shù)組（P值均＜0.01），但I(xiàn)L-6中和抗體處理組顯著小于IgG對照組（P＜0.05）。

2.2 腦梗死周邊區(qū)域炎性細(xì)胞比較 術(shù)后3 d，IL-6中和抗體處理組腦梗死周邊區(qū)域CD3+細(xì)胞數(shù)目和Iba-1+細(xì)胞數(shù)目分別為（27.06±3.01）和（56.81±3.47）個／mm3，IgG 對 照 組 分 別 為（51.73±3.99）和（99.88±3.63）個／mm3，IL-6中和抗體處理組腦梗死周邊區(qū)域CD3+細(xì)胞數(shù)目和Iba-1+細(xì)胞數(shù)目均顯著少于IgG對照組（P值均＜0.05）。見圖1。

圖1 IL-6中和抗體處理組和IgG對照組小鼠術(shù)后3 d腦組織免疫熒光染色結(jié)果

2.3 神經(jīng)功能評分比較 3組小鼠術(shù)前的神經(jīng)功能總評分的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）。在術(shù)后3、5、7、14、21、28 d，IgG 對照組和IL-6中和抗體處理組小鼠的神經(jīng)功能總評分均顯著低于假手術(shù)組（P值均＜0.01）。在術(shù)后5、7、14、28 d，IL-6中和抗體處理組小鼠的神經(jīng)功能總評分均顯著高于Ig G對照組（P值分別＜0.01、 0.05）。見表1。

表1 3組小鼠腦缺血后神經(jīng)功能總評分比較（N=10，x-±s，分）

2.4 黏紙實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 3組小鼠術(shù)前撕除黏紙時間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）。術(shù)后第1、2、3、4周，IgG對照組小鼠撕除黏紙時間均顯著長于假手術(shù)組（P值分別＜0.01、0.05）。術(shù)后第1周，IL-6中和抗體處理組小鼠撕除黏紙時間顯著長于假手術(shù)組（P＜0.01）。術(shù)后第1、2周，IL-6中和抗體處理組小鼠撕除黏紙時間均顯著短于IgG對照組（P值均＜0.01）。見表2。

表2 3組小鼠撕除黏紙時間比較（N=10，x-±s，s）

3 討 論

國內(nèi)外研究結(jié)果表明，急性腦卒中患者血清IL-6水平升高［3，7］，且腦卒中患者發(fā)病6 h內(nèi)腦脊液中IL-6水平與24 h腦梗死體積呈正相關(guān)［8］，提示IL-6參與了損傷早期的急性炎性反應(yīng)。IL-6水平與多種循環(huán)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，心房顫動患者的IL-6水平與腦卒中和大出血相關(guān)，也是血栓形成和死亡的危險(xiǎn)因素［9］；IL-6水平高的中年患者較IL-6水平低者，在10年內(nèi)更易發(fā)生認(rèn)知功能下降［10］。盡管升高的IL-6水平與腦卒中后致死致殘率相關(guān)，但亦有研究結(jié)果表明IL-6可在腦卒中后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能，這提示外周和中樞系統(tǒng)的IL-6可能在不同時間點(diǎn)發(fā)揮不同的作用。

IL-6與其受體結(jié)合后可激活兩種細(xì)胞內(nèi)信號通路——經(jīng)典信號通路和反式信號通路，從而產(chǎn)生不同的生物學(xué)反應(yīng)。經(jīng)典信號通路可發(fā)揮抗炎、促細(xì)胞新生和神經(jīng)保護(hù)作用，而反式信號通路具有促炎效應(yīng)。缺血性腦梗死發(fā)生后，多效性細(xì)胞因子IL-6激活后的生物學(xué)效應(yīng)復(fù)雜且尚未完全闡明，主要包括促炎和營養(yǎng)神經(jīng)兩方面效應(yīng)：①在腦梗死急性期可作為促炎細(xì)胞因子上調(diào)黏附分子表達(dá)促進(jìn)淋巴細(xì)胞募集，加重腦組織損傷；②在腦梗死亞急性期和遠(yuǎn)期，可作為神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進(jìn)血管和神經(jīng)元新生［11］。在腦梗死的不同臨床分期，通過干預(yù)IL-6對預(yù)后產(chǎn)生影響仍存在爭議。近期研究［12］結(jié)果表明，單純靜脈注射IL-6細(xì)胞因子可改善缺血性腦卒中小鼠的運(yùn)動功能，IL-6和可溶性IL-6受體共同注射可使腦梗死體積增大和浸潤的淋巴細(xì)胞數(shù)量增多。本研究主要關(guān)注腦梗死急性期IL-6中和抗體處理抑制腦組織急性期炎性反應(yīng)的作用。

不同時相的IL-6表達(dá)對神經(jīng)組織產(chǎn)生不同的作用，損傷前IL-6的正常表達(dá)或高水平表達(dá)可對神經(jīng)損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，但在神經(jīng)損傷發(fā)生后再增加IL-6的表達(dá)，會加重神經(jīng)損傷。本研究針對缺血性腦卒中后升高的IL-6予以中和抗體處理，減輕炎性反應(yīng)。目前針對缺血性腦卒中急性期炎性反應(yīng)的治療方法眾多，已有2期臨床試驗(yàn)靜脈給予缺血性腦卒中患者IL-1受體拮抗劑（IL-1R）治療急性期炎性反應(yīng)，可降低皮質(zhì)醇水平，逆轉(zhuǎn)腦卒中急性期的免疫抑制狀態(tài)［13］。在動物模型中預(yù)先給予選擇性TNF-α抑制劑（3，6’-二硫代沙利度胺）可縮小腦梗死體積，減少神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能。IL-6中和抗體治療也可減輕小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)和保護(hù)急性免疫性心肌炎等。

缺血性腦卒中后的炎性反應(yīng)進(jìn)程中存在多種促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1和IL-6。外周血、腦脊液和損傷處腦組織均可檢測到促炎細(xì)胞因子表達(dá)升高。IL-6等促炎細(xì)胞因子加重腦組織損傷的機(jī)制為多方面的，如誘導(dǎo)選擇素E、細(xì)胞間黏附因子1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附因子（VCAM-1）表達(dá)，這些位于內(nèi)皮細(xì)胞上的黏附因子與淋巴細(xì)胞表面的整合素結(jié)合，參與T淋巴細(xì)胞浸潤至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過程；同時激活的淋巴細(xì)胞釋放神經(jīng)毒性因子、蛋白水解酶，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放血小板激活因子、凝血因子Ⅷ等多種組織因子，促進(jìn)凝血過程和血栓發(fā)生；聚集于腦血管中的淋巴細(xì)胞影響腦血流，前述過程均加重局部腦缺血損傷［11，14］。

本研究結(jié)果表明，IL-6中和抗體處理能明顯縮小小鼠腦缺血后的腦梗死體積，抑制急性炎性細(xì)胞對腦組織的浸潤，從而改善腦梗死后28 d的長期神經(jīng)功能預(yù)后，提示IL-6中和抗體處理可能作為治療腦缺血損傷的有效方法。

綜上所述，缺血性腦卒中模型中IL-6中和抗體早期處理可能通過抑制急性期炎性反應(yīng)以縮小腦梗死體積和改善感覺運(yùn)動功能。通過IL-6中和抗體調(diào)節(jié)腦卒中后機(jī)體的炎性反應(yīng)，為臨床治療策略和新藥研發(fā)轉(zhuǎn)化提供了新的思路。