吳佳 匡艷輝 劉湘丹

摘要：目的? 研究不同采收期廣升麻產(chǎn)量及其蛻皮甾酮的含量，為廣升麻標(biāo)準(zhǔn)化栽培過程中采收期的確定提供依據(jù)。方法? 于不同采收期采集廣升麻植株，稱重法測(cè)定其根質(zhì)量;HPLC測(cè)定根中蛻皮甾酮含量，色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（45︰55，V/V），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果? 不同采收期廣升麻植株根質(zhì)量和根中蛻皮甾酮含量均呈動(dòng)態(tài)變化。根質(zhì)量在10月下旬達(dá)到最大值，之后基本穩(wěn)定;蛻皮甾酮含量于11月上旬達(dá)到最高，其后稍有下降。結(jié)論? 綜合根產(chǎn)量、蛻皮甾酮含量和廣升麻植株物候期，確定廣升麻根的最佳采收期為11月上、中旬。

關(guān)鍵詞：廣升麻;采收期;根;蛻皮甾酮

中圖分類號(hào)：R284.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）10-0081-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.018????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To study the dynamic change of the yield and ecdysterone of Serratulae Chinensis Radix in different harvest time; To provide scientific basis for determination of harvesting time in its standardized cultivation. Methods The weight of the root of Serratula chinensis at different harvest time was measured by weighing method. The content of ecdysterone in the sample was determined by HPLC. The column was ZORBAX Eclipse XDB-C18 （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） and the methanol-water （45：55， V/V） was mobile phase. The velocity of flow was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 248 nm with column temperature of 30 ℃. The injection volume was 10 μL. Results The root weight and ecdysterone content in different harvest time showed dynamic changes. The weight of root reached the maximum in late October， and then basically stabilized. The content of ecdysterone in root reached the maximum in early November， and then decreased slightly. Conclusion Integrating root yield， ecdysterone content and phenological phase of Serratula chinensis can determine that the best harvest time is the early and middle November.

Keywords： Serratulae Chinensis Radix; harvest time; root; ecdysterone

廣升麻來(lái)源于菊科植物麻花頭Serratula chinensis S. Moore的干燥塊根，其味辛、苦，性寒，歸胃、肺經(jīng)，具有解毒透疹、升陽(yáng)舉陷功效，用于熱毒咽腫、風(fēng)熱頭痛、麻疹不透等[1]。廣升麻主要分布于廣東、湖南、江西、浙江、福建、廣西等地，其中廣東韶關(guān)、湖南郴州、江西贛州交界地為其道地產(chǎn)區(qū)，而產(chǎn)于湖南郴州桂東、汝城地區(qū)者習(xí)稱汝升麻。研究表明，廣升麻中主要化學(xué)成分為蛻皮甾酮類、揮發(fā)油、腦苷脂、神經(jīng)酰胺類化合物等[2-7]。其中蛻皮甾酮是一種昆蟲蛻皮活性的天然甾體化合物，能促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，具有抗脂質(zhì)過氧化、抗內(nèi)皮細(xì)胞損傷、調(diào)節(jié)基因表達(dá)、降低膽甾醇等作用[8-9]。廣升麻根部入藥有降低膽固醇和治療腦血管疾病等作用，其治療腦缺氧、腦缺血效果尤為顯著，藥理研究表明該作用與蛻皮甾酮相關(guān)[10-11]。

隨著心腦血管疾病發(fā)病率不斷上升和年輕化，廣升麻的市場(chǎng)需求也日趨增長(zhǎng)，由于其野生資源減少，人工種植廣升麻供不應(yīng)求，探究廣升麻最佳采收期使其資源利用最大化具有十分重要的研究意義。因此，本試驗(yàn)采用HPLC測(cè)定2016年9月中旬-12月中旬采收的廣升麻樣品中蛻皮甾酮的含量，結(jié)合廣升麻物候期和根產(chǎn)量，以探究廣升麻的最佳采收期，為充分合理地利用廣升麻資源提供依據(jù)。

1? 儀器與試藥

1260Agilent型HPLC儀（包括G14212A型紫外檢測(cè)器、G4220A型二元泵、G1316C型色譜工作站和手動(dòng)進(jìn)樣器），美國(guó)Agilent公司;KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（功率500 W，頻率40 kHz），昆山市超聲儀器有限公司;DK-98-1數(shù)顯電熱水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司;LK-600A搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，上海精勝科學(xué)儀器有限公司;BT214D萬(wàn)分之一電子天平、CP225D十萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)Sartorius公司。

蛻皮甾酮對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-12122111，純度>98%）;甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純凈水。結(jié)合傳統(tǒng)采收時(shí)間和廣升麻物候期，于2016年9月10日-12月9日每隔10 d采挖樣品（編號(hào)1～10），每號(hào)地塊隨機(jī)取樣5株，共3個(gè)重復(fù)，取樣在樣地中具代表性，樣品經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源教研室周日寶教授鑒定為菊科植物麻花頭Serratula chinensis S. Moore的干燥塊根。樣品來(lái)源信息見表1。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇-水（45︰55，V/V）;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：248 nm;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2? 溶液制備

2.2.1? 對(duì)照品溶液

精密稱取蛻皮甾酮對(duì)照品20.48 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為204.8 μg/mL的對(duì)照品溶液;用移液管量取5 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為102.4 μg/mL的對(duì)照品溶液，置4 ℃冰箱避光保存。

2.2.2? 供試品溶液

將廣升麻樣品烘干，粉碎，過40目篩。取各采收期粉碎樣品約0.5 g，精密稱定，分別置于250 mL圓底燒瓶中，加甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，75 ℃加熱回流提取60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。取一定量的提取液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得，置4 ℃冰箱避光保存。

2.2.3? 陰性對(duì)照溶液

取甲醇50 mL，置于250 mL圓底燒瓶中，稱定質(zhì)量，75 ℃加熱回流提取60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。取一定量的提取液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3? 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見圖1。在該色譜條件下，蛻皮甾酮與其他峰分離良好，分離度>1.5，理論塔板數(shù)以蛻皮甾酮峰計(jì)為8482，保留時(shí)間約8.4 min。其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4? 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1869.3X+6.751（r=0.999 7）。結(jié)果表明，蛻皮甾酮的線性范圍為0.204 8～2.048 μg。

2.5? 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果蛻皮甾酮峰面積RSD=1.67%，表明儀器精密度良好。

2.6? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取7號(hào)供試品溶液適量，分別于室溫放置0、4、8、10、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果蛻皮甾酮峰面積RSD=1.98%，表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7? 重復(fù)性試驗(yàn)

取7號(hào)樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果蛻皮甾酮的平均含量為0.83%，RSD=1.23%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8? 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知蛻皮甾酮含量的7號(hào)樣品粉末0.25 g，共6份，置于50 mL棕色量瓶中，分別加入“2.2.1”項(xiàng)下濃度為204.8 μg/mL的對(duì)照品溶液10 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.9? 樣品測(cè)定

樣品采收后稱重，記錄各編號(hào)樣品干重、鮮重。按每株占地40 cm×40 cm，每畝3125株（666.7 m2÷0.16 m2×75%，排水溝占地25%），計(jì)算畝產(chǎn)量。前期試驗(yàn)測(cè)得折干率（干重/鮮重）為31%，計(jì)算折干畝產(chǎn)量。樣品按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品蛻皮甾酮含量，結(jié)果見表3。不同采收期畝產(chǎn)鮮重動(dòng)態(tài)變化見圖2，蛻皮甾酮含量動(dòng)態(tài)變化見圖3。

由表3、圖2、圖3可知，不同采收期廣升麻產(chǎn)量及蛻皮甾酮含量呈動(dòng)態(tài)變化：9月中旬至12月上旬，隨著采收期的推遲，廣升麻畝產(chǎn)鮮重呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)，10月下旬達(dá)到最大值，其后直至12月上旬基本保持穩(wěn)定;蛻皮甾酮含量于9月中旬至12月上旬呈現(xiàn)先升高后緩降直至基本平穩(wěn)的趨勢(shì)，10月底達(dá)峰值，11月上旬稍有下降后直至12月上旬基本趨于平穩(wěn)，且較10月底前蛻皮甾酮含量處于較高水平。

3? 討論

本試驗(yàn)進(jìn)行了提取方法考察，對(duì)比超聲提取和回流提取樣品前處理方法，結(jié)果回流提取效率高;對(duì)比提取溶劑乙醇、甲醇，回流時(shí)間30、60 min，結(jié)果甲醇回流提取60 min樣品的蛻皮甾酮提取效率更高。因而最終選擇甲醇75 ℃回流提取60 min。本試驗(yàn)對(duì)色譜條件中的流動(dòng)相比例進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，以甲醇-水（45︰55，V/V）流動(dòng)相，蛻皮甾酮分離效果好，與其他物質(zhì)分離度良好，且方法學(xué)穩(wěn)定，可用于廣升麻中蛻皮甾酮含量測(cè)定。

本研究對(duì)不同采收期廣升麻產(chǎn)量及蛻皮甾酮含量的變化規(guī)律進(jìn)行比較研究。廣升麻畝產(chǎn)量于9月中旬至12月上旬呈先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)，于10月下旬達(dá)峰值;蛻皮甾酮含量于9月中旬至12月上旬呈先上升后緩降直至平穩(wěn)的趨勢(shì)，10月下旬達(dá)峰值。10月中旬至10月下旬，蛻皮甾酮含量呈急劇上升趨勢(shì)，且10月下旬畝產(chǎn)量已達(dá)峰值。綜合考慮2項(xiàng)指標(biāo)，10月下旬即可開始采收，再結(jié)合廣升麻物候期及農(nóng)藝性狀，初步確定廣升麻的最佳采收期為11月上、中旬，即植株地上部分枯萎時(shí)期，以保障畝產(chǎn)量、蛻皮甾酮含量均高，為合理采收廣升麻藥材提供了依據(jù)。

廣升麻的常規(guī)入藥部位為干燥塊根，在產(chǎn)地采收加工時(shí)多除去蘆頭及須根[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，廣升麻須根數(shù)量多，相對(duì)產(chǎn)量較大，故進(jìn)行了不同粗細(xì)廣升麻蘆頭、須根中蛻皮甾酮含量初步比較，結(jié)果同一時(shí)期采收的不同規(guī)格（直徑<2 mm、2 mm<直徑<6 mm、直徑>6 mm）的廣升麻蘆頭、須根中蛻皮甾酮含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示可進(jìn)行擴(kuò)大廣升麻入藥部位的相關(guān)研究，使其資源利用最大化。

參考文獻(xiàn)：

[1] 廣東中藥志編委會(huì).廣東中藥志：一卷[M].廣州：廣東科技出版社， 1994：142-144.

[2] 蔡巧燕，曾建偉，林珊，等.廣升麻質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，21（4）：38-40.

[3] 李毅然，陳玉萍，黃艷，等.升麻與廣升麻揮發(fā)油成分的GC-MS分析[J].廣西中醫(yī)藥，2012，35（4）：56-59.

[4] 黃馳.廣升麻的提取物、其制備方法及其用途：200410014710.6[P]. 2006-03-22.

[5] 凌鐵軍，馬文哲，魏孝義.華麻花頭根中的蛻皮甾酮類成分[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2003，11（2）：143-147.

[6] LING T， XIA T， WAN X， et al. Cerebrosides from the roots of Serratula chinensis[J]. Molecules，2006，11（9）：677-683.

[7] 凌鐵軍，吳萍，劉梅芳，等.華麻花頭根中的神經(jīng)酰胺成分[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2005，13（5）：403-407.

[8] 王剛濤，張旭輝，張衛(wèi)東，等.蛻皮甾酮對(duì)脂多糖誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].天津醫(yī)藥，2015，43（6）：587-589.

[9] 朱玉霞，孫麗莎，楊矯，等.蛻皮甾酮對(duì)2型糖尿病大鼠肝細(xì)胞IRS-2蛋白表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥，2014，54（33）：10-12.

[10] 羅春霞，張映琦，遲路湘，等.蛻皮甾酮對(duì)大鼠局灶性腦梗死的保護(hù)作用及機(jī)制初討[J].西南國(guó)防醫(yī)藥，2009，19（2）：176-178.

[11] 王洪明，陳煒，劉冬潔，等.HPLC測(cè)定牛膝和決津顆粒中β-蛻皮甾酮的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（9）：122-125.

[12] 肖浩.廣升麻質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

（收稿日期：2018-09-21）

（修回日期：2019-02-18;編輯：陳靜）